Dan Huang 1,2,3, Huawei Hu 3, Liping Chang 3, Shen Liu 4, Junqing Liang 3, Yanfei Song 3, Xindong Wang 1,2, Hui Zhang 5, Cong Wei 3, Yiling Wu 3

Contribuții: (I) Concepție și proiectare: Y Wu, C Wei, D Huang; (II) Suport administrativ: Y Wu; (III) Furnizarea de materiale de studiu sau pacienți: H Hu, L Chang, J Liang, Y Song; (IV) Colectarea și asamblarea datelor: D Huang, S Liu, X Wang, H Zhang; (V) Analiza și interpretarea datelor: D Huang; (VI) Scrierea manuscriselor: Toți autorii; (VII) Aprobarea finală a manuscrisului: Toți autorii.

Fundal: Dislipidemia este unul dintre mecanismele aterosclerozei (SA). Epuizarea estrogenului joacă un rol cheie în patogeneza AS postmenopauzei la femei, iar nivelul lipidelor din sânge al femeilor este strâns legat de nivelul de estrogen endogen. Fitoestrogenii (PE) exercită efecte estrogenice, inclusiv protecție împotriva SA, fără efectele adverse ale administrării de estrogen. Capsula Bazi Bushen (BZBS) este o rețetă compusă pe bază de plante din medicina tradițională chineză care s-a dovedit că conține 11 PE unice. În studiul de față, am evaluat efectele BZBS împotriva tulburărilor metabolismului lipidic.

Metode: Toți șoarecii ApoE -/- au suferit ligatură ovariană și ovariectomie bilaterală (Ovx) pentru a induce menopauză chirurgicală (șoareci Ovx/ApoE -/-), în timp ce șoarecii C57BL/6J au fost supuși unei intervenții chirurgicale simulate (filetarea acului). Șoarecii Ovx/ApoE -/- au primit o dietă bogată în grăsimi fără estrogen și șoarecii C57BL/6J au primit o dietă normală timp de 12 săptămâni. Șoarecii Ovx/ApoE -/- tratați cu G1, un agonist extrem de selectiv al receptorului de estrogen cuplat la proteina G (GPER1) cu activitate dovedită împotriva SA, au fost folosiți ca martori pozitivi. Au fost măsurate nivelurile de estrogen și s-a calculat indicele de atrofie uterină pentru a determina succesul modelului. Nivelurile serice de trigliceride (TG), colesterol total (TC), colesterol lipoproteic cu densitate scăzută (LDL-C) și colesterol lipoproteic cu densitate mare (HDL-C) au fost măsurate în fiecare grup. Proiecțiile ortogonale către modelul de analiză discriminantă a structurilor latente (OPLS-DA) au fost utilizate pentru a separa grupurile, MetaboAnalyst a fost apoi folosit pentru a analiza calea metabolică, iar cei mai reprezentativi metaboliți au fost identificați în cele din urmă.

Rezultate: Îndepărtarea ovarelor bilaterale a condus la modele chirurgicale de menopauză de succes, în care BZBS a crescut nivelul de estrogen, dar nu a crescut riscul de proliferare uterină. BZBS a atenuat dislipidemia, incluzând niveluri scăzute de TG, TC și LDL-C, dar niveluri crescute de HDL-C. Modelul OPLS-DA a distins cu succes grupurile cu o bună capacitate predictivă și a dezvăluit tendința lor de a se separa unul de celălalt. MetaboAnalyst a sugerat că atât grupul G1, cât și doza mare de BZBS (HD-BZ) ar putea îmbunătăți efectul metabolismului lipidic: calea metabolismului glicerofosfolipidic a fost îmbunătățită în principal de grupul G1, în timp ce calea metabolismului inozitol fosfat a fost îmbunătățită în principal de către HD- Grupul BZ. Pentru cei patru compuși cu cel mai mare conținut, concentrațiile de acid docosahexaenoic (DHA), acid 3-hidroxibutiric și acid 5 (Z), 8 (Z), 11 (Z) -eicosatrienoic au fost dramatic mai mici în grupul model comparativ cu grupul de control. Lizofosfatidiletanolamina (18: 0) a fost mai mare în grupul model decât în ​​grupul martor. BZBS a corectat aceste efecte.

Concluzii: Tratamentul cu BZBS a redus nivelurile serice de lipide și a îmbunătățit metabolismul acizilor grași la șoarecii menopauzi ApoE -/- hrăniți cu diete cu conținut ridicat de grăsimi.

Cuvinte cheie: Ateroscleroza (SA); Capsule de bază Bushen; profilul lipidic; metabonomie

Trimis pe 25 martie 2020. Acceptat pentru publicare 28 aprilie 2020.

Introducere

Ateroscleroza (SA), patologia comună de bază a bolilor cerebrale și cardiovasculare, este principala cauză de deces la nivel mondial (1,2). Riscul de SA la femeile aflate în premenopauză este mult mai mic decât la bărbați; cu toate acestea, riscul crește semnificativ după menopauză. Aceste diferențe sugerează că estrogenul, un hormon steroid care îndeplinește diferite funcții fiziologice prin legarea la receptorii săi corespunzători, joacă un rol de protecție cheie în patogeneza AS (3). Dislipidemia este unul dintre mecanismele AS. Nivelul lipidelor din sânge la femei este strâns legat de nivelul de estrogen endogen (4). Estrogenul este sintetizat în ovare folosind colesterolul lipoproteic cu densitate mică (LDL-C) ca substrat. Cu toate acestea, LDL-C din sângele femeilor aflate în postmenopauză nu poate fi utilizat pentru a sintetiza estrogenul, ducând la deficit de estrogen și dislipidemie suplimentară (5). Acumularea de grăsime subcutanată și viscerală la femeile aflate în postmenopauză este mai evidentă decât înainte de menopauză, ducând la metabolismul anormal al acizilor grași. Descompunerea trigliceridelor (TG) în glicerol și acizi grași liberi crește, ceea ce a crescut depunerea lipidelor (6).

În ciuda activității de protecție vasculară puternică a estrogenului, aplicația sa clinică a fost limitată de mai multe efecte secundare potențiale, cum ar fi durerile de cap, tromboza, hiperplazia endometrială cu risc crescut de cancer, durerea de sân și alte tulburări (7). Fitoestrogenii (PE), molecule care conțin inel fenolic, având o structură similară cu estrogenul, se pot lega de receptorii de estrogen. Ei exercită activitate estrogenică de protecție împotriva SA fără efectele adverse cauzate de administrarea de estrogen (7). Capsula Bazi Bushen (BZBS; Capsula tonificatoare a rinichilor cu opt semințe) este un compus din plante folosit în medicina tradițională chineză. Este derivat din Wuzi Yanzong Wan (Cinci semințe de progenie), care este o altă rețetă populară, înregistrată faimos de un medic pe nume Li Chan (1518-1593) în timpul dinastiei Ming în cartea sa Yi Xue Ru Men (Introducere în medicină) . Am identificat 14 componente în BZBS, dintre care 11 au fost PE, inclusiv epimedin A, icariin, baohuoside I, isoquercitrin, hyperoside, osthole, imperatorin, deoxyschizandrin, schisandrin B, catalpol și verbascoside.

Pentru acest studiu, ne-am propus să evaluăm utilizarea potențială a BZBS împotriva metabolismului lipidic. În acest scop, am examinat efectele gavajelor orale BZBS asupra lipidelor din sânge și a metabolomicii serice la șoarecii ovariectomizați (Ovx) ApoE -/- șoareci, un model animal al AS postmenopauză. G1, un agonist selectiv al receptorului de estrogen cuplat la proteina G (GPER1), care sa dovedit deja că scade nivelul lipidelor din sânge și împiedică AS în condițiile post-menopauzei, a fost folosit ca un control pozitiv. Rezultatele noastre au arătat că BZBS a redus nivelurile serice de lipide și a îmbunătățit metabolismul lipidic la șoarecii Ovx/ApoE -/- prin afectarea căilor de metabolizare a acizilor grași.

Vă prezentăm următorul articol în conformitate cu lista de verificare a raportării ARRIVE (disponibil la http://dx.doi.org/10.21037/apm-20-906).

Metode

Pregătirea și controlul calității (QC) al BZBS

Probele BZBS au fost obținute de la Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., Ltd (Shijiazhuang, China). BZBS este format din 14 componente. În procesul de producție a BZBS, speciile, originea, timpul de recoltare, părțile medicinale și metodele inventate pentru fiecare componentă au fost strict standardizate în conformitate cu Farmacopeea chineză (ediția 2015). Stabilitatea produsului a fost verificată prin analiza cromatografiei lichide ultra-performante (UPLC) a 12 loturi de BZBS. Cromatografele respective și cele 14 „amprente digitale” identificate sunt prezentate în Figura 1A și B. BZBS a fost administrat ca injecție intragastrică la șoareci într-o suspensie de 0,5% carboximetil celuloză de sodiu (CMC).

capsulă

Pregătirea G1

G1 a fost achiziționat de la ApexBio (Houston, TX, SUA). O soluție stoc a fost preparată prin dizolvarea G1 în etanol absolut la 20 pg/ml. Soluția de lucru (2 μg/ml) a fost preparată prin diluarea stocului în 9 volume ale vehiculului apos (0,9% NaCI, 0,1% albumină și 0,1% Tween-20). Șoarecii au fost injectați subcutanat cu 100 pl de soluție de lucru în fiecare zi (8).

Gruparea și administrarea medicamentelor

Șaizeci de șoareci homozigoti femele ApoE -/- (cu fundal C57BL/6J) și cincisprezece șoareci femele martor C57BL/6J (cu vârsta de 6-8 săptămâni și cântărind 18-22 g) au fost achiziționați de la GemPharmatech Co., Ltd. (Nanjing, China). Toți șoarecii au fost găzduiți într-o instalație standard la 22 ° C sub un ciclu de 12 ore lumină-întuneric, cu hrană și apă disponibile ad libitum. După o perioadă de adaptare de 3 zile, toți șoarecii ApoE -/- au suferit ligatură ovariană și ovariectomie bilaterală (Ovx) în condiții sterile pentru a induce menopauză chirurgicală (șoareci Ovx/ApoE -/-), în timp ce șoarecii C57BL/6J au suferit o intervenție chirurgicală simulată ( filetarea acului). Animalele au fost lăsate să se recupereze timp de 7 zile pentru a se asigura că hormonii sexuali din corpul lor au fost eliminați. Ulterior, șoarecii Ovx/ApoE -/- au fost repartizați aleatoriu în patru grupuri (n = 15 per grup): grupul model (dietă bogată în grăsimi + CMC prin injecție intragastrică), grupul de tratament G1 (dietă bogată în grăsimi + G1 0,2 µg/zi prin injecție subcutanată), grupul cu doze mari de BZBS (HD-BZ) (dietă bogată în grăsimi + 2,8 g/kg/zi BZBS prin injecție intragastrică) și grupul cu doze mici de BZBS (LD-BZ) (dietă bogată în grăsimi + 1,4 g/kg/zi BZBS prin injecție intragastrică). Cei 15 șoareci C57BL/6J au fost folosiți ca grup de control (dietă normală + CMC prin injecție intragastrică).

Dieta normală (dieta comercială standard) a fost achiziționată de la Moldiets Co., Ltd (Chengdu, China). Dieta bogată în grăsimi (fără PE, 40 kcal% grăsimi, 1,25% colesterol și 0,5% acid colic) a fost achiziționată de la Research Diets, Inc (New Brunswick, NJ, SUA).

Determinarea indicelui de atrofie a uterului (mg/g)

După 12 săptămâni pe o dietă normală sau bogată în grăsimi, toți șoarecii au fost postiti peste noapte și cântăriți pentru ultima dată. Animalele au fost sacrificate și fiecare uter a fost luat și cântărit. Pentru fiecare șoarece, a fost determinat un indice de atrofie a uterului, care a fost definit ca greutatea uterului (în mg) împărțit la greutatea corporală totală (în g).

Analize ale nivelului seric de estradiol și lipide

Serul șoarecilor din fiecare grup a fost separat prin centrifugare la 3.000 rpm timp de 15 minute și colectat. Măsurătorile de estradiol (E2) au fost efectuate de către Institutul Beijing North of Biotechnology Co., Ltd. (Beijing, China). Seturile biochimice de colesterol total (TC), TG și LDL-C au fost achiziționate de la Beijing Strong Biotechnologies, Inc. (Beijing, China). Nivelurile lipidice au fost detectate de un analizor biochimic automat (Hitachi 7080, Japonia).

Extragerea probelor și analiza cromatografiei lichide ultra-performante-spectrometrie de masă (UPLC-MS)

Serul de la șoareci a fost procesat pentru a fi supus analizei de cromatografie lichidă ultra-performantă-spectrometrie de masă (UPLS-MS). Extracția și analiza s-au efectuat așa cum s-a descris anterior cu câteva modificări (9). Pe scurt, 50 uL de ser au fost adăugați într-un tub care conține 200 uL de precipitator mixt (metanol: acetonitril la 5: 3, v/v) pentru a extrage metaboliți și a precipita proteine. O alicotă de 20 uL din fiecare supernatant a fost amestecată pentru probe QC de performanță. Metaboliții serici au fost separați utilizând o coloană ACQUITY UPLC HSS T3 (2,1 uL × 150 mm × 1,8 mm) (Waters Corp., Milford, MA, SUA) la 40 ° C și la un debit de 0,35 ml/min. Volumul injecției a fost de 3 uL; cele două faze mobile și separarea au fost descrise anterior (9). Un spectrometru de masă AB5600 echipat cu sursă de ionizare prin pulverizare electronică (ESI) a fost utilizat pentru a obține profiluri spectrale de masă (AB Sciex LLC, Redwood City, CA, SUA). Parametrii de funcționare optimizați au fost după cum urmează: tensiunea sursei, 5,50 kV (mod pozitiv) și 4,50 kV (modul negativ); spectrele de masă au fost achiziționate prin scanare în intervalul 50-1200 m/z.

analize statistice

Proiecția ortogonală către analiza discriminantă a structurilor latente (OPLS-DA) a fost efectuată cu software-ul SIMCA-P 13.0 (Umetrics AB, Umeå, Suedia) pe baza setului de date. Analiza statistică a fost făcută prin analiza unică a varianței (ANOVA) dacă s-au comparat mai mult de două grupuri. Analiza corelației a fost efectuată utilizând software-ul SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, SUA). Diferențe cu valoarea P.

Rezultate

Tratamentul cu BZBS a crescut nivelurile serice de estradiol fără proliferare uterină

Comparativ cu grupul de control, nivelurile E2 ale grupului model au fost substanțial mai mici, confirmând că ovariectomia bilaterală a dus la o stare post-menopauză. Nu a existat nicio modificare semnificativă a nivelurilor E2 între grupul G1 și grupul model. În schimb, concentrația de E2 a fost crescută atât în ​​grupul HD-BZ, cât și în grupul LD-BZ (Figura 2A).

Tratamentul cu BZBS a îmbunătățit nivelurile serice de lipide la șoarecii Ovx/ApoE -/-

Șoarecii Oxv ApoE -/- au fost hrăniți cu o dietă aterogenă timp de 12 săptămâni. La sfârșitul acestei perioade, nivelurile serice de lipide au fost evaluate pentru a evalua dacă tratamentul cu BZBS ar putea îmbunătăți nivelurile de lipide serice. Nivelurile serice ale tuturor lipidelor au fost semnificativ mai mari în grupul model decât în ​​grupul martor. În cazul TC, TG și LDL-C, tratamentul cu G1 sau BZBS a scăzut semnificativ statistic aceste niveluri comparativ cu grupul model, cu doze mari de BZBS având un efect mai puternic decât doze mici de BZBS. În schimb, tratamentul cu G1 și BZBS a crescut nivelul HDL-C chiar mai mare, dar efectul a fost mai mare în grupul cu doze mici de BZBS (Figura 3).

Tratamentul cu BZBS afectează căile metabolice ale acizilor grași

MetaboAnalyst a fost utilizat pentru a analiza calea metabolică. Principalele diferențe dintre grupul model și grupul martor s-au dovedit a fi metabolismul glicerofosfolipidic și calea metabolismului inozitol fosfat (Figura 5A). Figura 5B arată că diferența dintre G1 și grupul model a fost îmbunătățirea a 2 căi, și anume, metabolismul glicerofosfolipidic și metabolismul fosfatului inozitol. Conform Figura 5C, diferența dintre G1 și grupul de control normal a fost concentrată în principal pe metabolismul fosfatului inozitol; cu alte cuvinte, a îmbunătățit aproape complet calea metabolismului glicerofosfolipidelor. Între timp, Figura 5D ilustrează diferența dintre grupul HD-BZ și grupul model. Grupul HD-BZ a îmbunătățit, de asemenea, cele două căi ale metabolismului glicerofosfolipidic și al metabolismului fosfatului inozitol. Figura 5E arată diferența dintre grupul HD-BZ și grupul normal. Spre deosebire de G1, grupul HD-BZ a restabilit calea metabolismului fosfatului inozitol la un nivel normal. Rezultatele sugerează că atât G1, cât și HD-BZ ar putea îmbunătăți efectul metabolismului lipidic: calea metabolismului glicerofosfolipidic a fost îmbunătățită în principal în grupul G1, în timp ce calea metabolismului inozitol fosfat a fost îmbunătățită în principal în grupul HD-BZ.

Tratamentul cu BZBS a îmbunătățit metabolismul compușilor diferențiali asociați acizilor grași

Pentru cei 4 compuși cu cel mai mare conținut, concentrațiile de acid docosahexaenoic (DHA); Acid 3-hidroxibutiric; și acidul 5 (Z), 8 (Z), 11 (Z) -eicosatrienoic au fost dramatic mai mici în grupul model comparativ cu grupul martor. G1 și BZBS au avut tendința de a atenua acest efect, deoarece au restabilit nivelul la normal. În schimb, nivelul lizofosfatidiletanolaminei (18: 0) a fost mai mare în grupul model decât în ​​grupul martor. G1 și BZBS au atenuat din nou efectul prin scăderea concentrației la niveluri mai apropiate de cea a grupului de control (Figura 6A, B, C, D). Aceste rezultate indică faptul că atât metabolomul cât și moleculele endogene mici au demonstrat efectul BZBS.

Discuţie

Estrogenul are trei receptori: receptorul nuclear clasic (ER α și ER β) și receptorul de membrană GPER1 (10). Agonistul GPER1 G1 a fost selectat ca un control pozitiv deoarece G1 este lipsit de activitate uterotrofică, care este similară cu PEs (11). Studiul nostru a demonstrat că BZBS nu a prevenit atrofia uterină la șoarecii Ovx/ApoE -/- (Figura 2B). Se știe că, după încetarea producției de estrogen de către ovare, biosinteza E2 are loc în țesuturile periferice, în special în țesutul adipos, prin conversia aromatazei a androgenilor la femeile aflate în postmenopauză (12). Mai multe studii au arătat că PE-urile cresc nivelul E2 la șoarecii femele, iar BZBS poate crește, de asemenea, nivelurile serice de E2 (13,14). Acest lucru este probabil deoarece PE-urile se pot lega competitiv de ERα și ERβ, iar cantitatea de ER din plasmă este limitată. Estrogenul endogen nu se poate lega de receptor și va fi nelegat în plasmă, ducând la o creștere a nivelurilor plasmatice E2 (13,15). Ca medicament tradițional chinezesc, BZBS este compus dintr-un amestec molecular complex și are efecte multi-țintă. Astfel, nu se poate exclude faptul că ERα și ERβ joacă un rol în activitatea BZBS.

Concluzii

Studiul nostru a demonstrat că tratamentul cu BZBS a redus nivelul lipidelor serice și a îmbunătățit metabolismul acizilor grași la șoarecii ApoE -/- menopauzi induși chirurgical, alimentați cu diete grase. Descoperirile noastre indică faptul că BZBS poate fi un potențial agent farmaceutic pentru prevenirea SA la femeile aflate în post-menopauză.

Mulțumiri

Finanțare: Această lucrare a fost susținută de Programul național cheie de cercetare și dezvoltare - Modernizarea medicinei tradiționale chineze (numărul grantului 2017YFC1700501) și Fundația Națională pentru Științe Naturale din China (numărul grantului 81973766).

Notă de subsol

Lista de verificare a raportării: Autorii au completat lista de verificare a raportării ARRIVE. Disponibil la http://dx.doi.org/10.21037/apm-20-906

Conflicte de interese: Toți autorii au completat formularul de divulgare uniformă ICMJE (disponibil la http://dx.doi.org/10.21037/apm-20-906). Toți autorii raportează subvenții de la Centrul Național China pentru Dezvoltarea Biotehnologiei, subvenții de la Fundația Națională de Științe Naturale din China, în timpul desfășurării studiului.

Declarație etică: Autorii sunt responsabili pentru toate aspectele lucrării, asigurându-se că întrebările legate de acuratețea sau integritatea oricărei părți a lucrării sunt investigate și rezolvate în mod corespunzător. Toate experimentele pe animale au fost executate în conformitate cu Ghidurile și politicile pentru chirurgia animalelor de la Hebei Yiling Chinese Medicine Research Institute (Shijiazhuang, China) și aprobate de Comisia etică de îngrijire a animalelor sub numărul de aprobare N2018050 (20180711).