Rita A Trammell

1 Departamentele de Medicină Internă Springfield, Illinois

Linda A Toth

2 Farmacologie, Școala de Medicină a Universității Southern Illinois, Springfield, Illinois

Abstract

Șoarecii de laborator sunt speciile preferate pentru multe tipuri de cercetare a bolilor infecțioase. Cu toate acestea, studiile privind bolile infecțioase implică adesea șoarecii să se îmbolnăvească și probabil să moară ca urmare a provocărilor infecțioase la care sunt expuși. Această probabilitate a determinat interesul pentru identificarea obiectivelor experimentale umane care mențin integritatea științifică a experimentului sau testului. 5.6 Dezvoltarea unor markeri obiectivi exacți care ar putea fi utilizați pentru a prezice eventuala deces și a declanșa eutanasia preventivă ar fi, prin urmare, utilă atât în ​​ceea ce privește atenuarea suferinței animalelor, cât și permiterea efectuării procedurilor terminale și a colectării probelor antemortem.

Obiectivele experimentale din cercetarea biomedicală ar trebui stabilite pe baza unei combinații de considerații științifice, etice, juridice, practice și umane. Scopul nostru în acest studiu a fost de a determina dacă criteriile care au fost propuse pentru predicția morții iminente în studiile de longevitate 11 pot fi aplicate studiilor relativ acute ale bolilor infecțioase. Datele din studiile efectuate din alte motive au fost colectate și analizate retrospectiv pentru a determina dacă măsurile de greutate corporală (BW) și temperatură ar putea fi utilizate pentru a diferenția șoarecii care ar trăi de cei care ar muri într-o varietate de modele de boli infecțioase.

Materiale și metode

Toți șoarecii au fost cumpărați de la laboratorul Jackson și au fost adăpostiți în grupuri de același sex de 5 din 11 în. × 7 in. × 5 in. cuști. Cuștile erau cuști deschise în stil solid, cu cutie de pantofi, cu așternut din așchii de lemn (Beta Chip, Northeastern Products, Warrensburg, NY). Șoarecii au fost întreținuți folosind practici convenționale de creștere, cu cuștile schimbate săptămânal. Temperatura camerei a fost menținută la 70 ± 2 ° F (21,1 ± 1,2 ° C) și umiditatea relativă de la 40% la 60%. Majoritatea șoarecilor au fost hrăniți cu LabDiet 5001 (PMI Nutrition International, St Louis, MO), deși un grup a primit o dietă bogată în grăsimi (D12492, 60 kcal% grăsime, Research Diets, New Brunswick, NJ). Alimentele și apa de la robinet erau disponibile ad libitum. Toți șoarecii nu prezintă infecții cunoscute cu virusul hepatitei șoarecilor, virusul șoarecilor, parvovirusul șoarecelui, norovirusul șoarecelui, virusul Theiler murine encefalomielită, diareea epizootică a șoarecilor sugari, virusul Sendai, Mycoplasma pulmonis, virusul pneumoniei șoarecilor, reovirusul 3, virusul coriomeningitei limfocitare, virusul ectromeliei și endo- și ectoparaziții, monitorizați prin utilizarea testării lunare a șoarecilor santinelă găzduiți în aceeași cameră. Comitetul de îngrijire și utilizare a animalelor de laborator de la Școala de Medicină a Universității Southern Illinois a aprobat toate animalele și procedurile experimentale utilizate în acest studiu.

Măsurarea temperaturii.

Pentru majoritatea studiilor, șoarecii au fost implantați sub anestezie cu izofluran cu un microcip subcutanat care permite măsurarea la distanță a temperaturii corpului utilizând un cititor de tip baghetă (model IPTT300, BioMedic Data Systems, Seaford, DE). Microcipul a fost implantat utilizând un dispozitiv de livrare care implică un ac de calibru 12, fără incizie sau închidere a plăgii. Cipurile individuale nu au fost testate pentru precizie sau altfel calibrate înainte de utilizare, dar au fost utilizate conform recomandărilor producătorului. Șoarecii inoculați cu Candida albicans au fost implantați sub anestezie ketamină-xilazină cu transmițătoare intraperitoneale pentru a permite măsurarea continuă a temperaturii corpului printr-un receptor plasat sub cușcă. 15

Studiul a fost o evaluare retrospectivă a șoarecilor expuși la diverse provocări infecțioase pentru utilizare în alte studii. Șoarecii au fost evaluați cel puțin zilnic atât înainte, cât și după inoculare. Temperaturile și greutățile corpului au fost măsurate în perioada de 2 ore după apariția luminii. Pentru șoarecii cu emițătoare abdominale, valorile de temperatură care au fost analizate au fost valorile medii obținute pe parcursul celor 2 ore după apariția luminii. Obiectivele clinice pentru eutanasia preventivă au inclus hipotermia palpabilă (în experiența noastră de șoareci care au fost implantate cu transmițătoare de temperatură telemetrice în diferite condiții infecțioase, hipotermia palpabilă reflectă, în general, o temperatură corporală mai mică de 25 ° C), incapacitatea sau lipsa de dorință de a merge, lipsa de răspuns la manipulare și dispnee sau cianoză severă. Șoarecii care au dezvoltat oricare dintre aceste semne au fost eutanasiați imediat și au fost considerați că au murit.

Provocări infecțioase.

Tulpina gripală A/HK/x31 (H3N2).

Stocurile virale de tulpină gripală A/HK/X31 (H3N2) (X31) au fost preparate prin inocularea ouălor de pui embrionate. Lichidul alantoic infectat cu virus a fost recoltat și alicote congelate la -80 ° C până la utilizare. Titrul stocului viral a fost determinat utilizând un test TCID50. Pentru a crea o infecție gripală, șoarecii A/J masculi adulți (n = 11) au fost anesteziați ușor și inoculați intranazal cu 25 µL de lichid alantoic conținând între 5 × 10 1 și 5 × 105 TCID50 tulpina virusului X31, așa cum s-a descris anterior. 16 Din experiența noastră de utilizare a acestui virus, cea mai mare doză utilizată aici la șoarecii A/J nu este letală pentru șoarecii C57BL/6J sau BALB/cByJ. Eutanasia a fost efectuată prin exanginare sub anestezie cu izofluran.

Streptococcus pneumoniae tulpina D39 (serotipul 2).

S. pneumoniae care fusese transformată cu operonul lux 2 a fost obținută de la doctorul Jonathan McCullers (Spitalul de cercetare pentru copii St Jude, Memphis, TN). Pentru prepararea stocurilor, coloniile bacteriene izolate dintr-un agar de soia triptic suplimentat cu 3% sânge de oaie defibrinat (plăci de agar din sânge, Enova Medical, St Paul, MN) au fost inoculate în bulion Todd Hewitt (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) și crescute la 37 ° C la o densitate de OD620 0,6 până la 0,7. Glicerina sterilă a fost adăugată la o concentrație finală de 16,7% înainte de congelarea alicoturilor la -80 ° C. Diluțiile seriale ale stocurilor bacteriene au fost plasate în triplicat pe plăci de agar din sânge pentru a obține titlul. Pentru inocularea șoarecilor, stocul bacterian a fost diluat în soluție salină sterilă fără endotoxine, iar șoarecii BALB/cByJ masculi adulți (cel puțin 4 șoareci pe doză; total n = 36) au fost inoculați intranazal cu 25 µL de diluții seriale de 10 ori stoc, cu doze cuprinse între 1 × 10 2 și 1 × 10 7 cfu. LD50 al tulpinii de S. pneumonie transformate în lux D39 pentru șoarecii BALB/cByJ a fost de 1 × 10 5,2 ufc, care este identic cu LD50 al tulpinii bacteriene de tip sălbatic. 12 Eutanasia a fost efectuată prin exsanguinare sub anestezie cu izofluran.

Tulpina gripală A/Puerto Rico/8/34 (H1N1).

Stocurile virale A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (P8) au fost furnizate cu amabilitate de Richard Webby (St Jude Children's Research Hospital) și preparate prin inocularea ouălor de pui embrionate. Lichidul alantoic infectat cu virus a fost recoltat și alicote au fost înghețate la -80 ° C până la utilizare. Titrul stocului viral a fost determinat utilizând un test TCID50.

În studiul șoarecilor BALB/cByJ, stocul viral a fost diluat în soluție salină sterilă fără endotoxine. Patru șoareci adulți BALB/cByJ masculi pe doză (total, n = 28) au fost inoculați intranasal cu 25 (L de diluții seriale de 10 ori ale stocului, cu doze cuprinse între 1 × 10 1 și 1 × 107 TCID50 PR8. LD50 al PR8 pentru șoarecii BALB/cByJ a fost 1 × 10 3,5 TCID50.

În studiul șoarecilor C57BL/6J, șoarecii au fost hrăniți fie cu o dietă normală (4,5% grăsimi; n = 10), fie cu o dietă bogată în grăsimi (60% grăsimi; n = 9) de la 6 la 34 de săptămâni. Șoarecii au fost apoi inoculați cu 25 uL de lichid alantoic conținând 1 × 103 TCID50 PR8 (1/3 din doza LD50 pentru șoarecii BALB/cByJ). Eutanasia a fost efectuată prin exanginare sub anestezie cu izofluran.

C. albicans (pagina 10231).

C. albicans a fost cultivat peste noapte pe agar dextroză Sabouraud. Pentru inocularea intravenoasă a șoarecilor, coloniile au fost suspendate în soluție salină sterilă, fără pirogen. Titrul culturii a fost estimat utilizând un hemocitometru, iar suspensia a fost diluată pentru a obține aproximativ 5 × 105 ufc în 0,2 ml. Dozele inoculate efective au fost determinate ulterior prin cultura de diluții seriale ale inoculului placat pe Sabarud Dextrose agar și au relevat o doză medie de 5,6 ± 0,6 × 105 ufc (n = 24). Pentru inoculare, șoarecii DBA/2J masculi adulți (n = 24) au fost anesteziați cu izofluran și injectați intravenos prin sinusul retroorbital. Calea retroorbitală a fost utilizată din 2 motive: 1) injecția se efectuează sub anestezie generală și, prin urmare, nu necesită reținere a animalelor și 2) deoarece sinusul este mare în raport cu o venă, administrarea substanțelor pe această cale este extrem de ușor de realizat și oferă o mare asigurare că materialul injectat a intrat în circulație mai degrabă decât în ​​spațiul perivascular. Studiul a fost încheiat prin proiectare la 5 zile după inoculare. Eutanasia a fost efectuată prin exanginare sub anestezie cu izofluran.

Statistici.

Măsurile descriptive au constat în mijloace și erori standard ale mijloacelor. Analiza statistică a fost efectuată cu teste t independente cu semnificație statistică stabilită la nivelul de 5%.

Rezultate

Șoarecii A/J (n = 11) au fost inoculați intranasal cu o serie de doze de tulpină de virus gripal X31 (1 × 10 1,65 până la 1 × 10 5,65 TCID50; n = 2 până la 3 pe doză). Dintre acești șoareci, 63% (7 din 11) au supraviețuit până în ziua 21 după infecție (Figura 1). Valorile pentru temperatură (T) și produsul temperaturii și greutății corporale (T × BW) la șoareci care au trăit în comparație cu cei morți au arătat semnificativ susținut (P Figura 1). Utilizarea valorii pragului unei scăderi a temperaturii miezului sub 35 ° C în ziua 7 după infecție ar fi detectat toți cei 4 șoareci care au murit în cele din urmă, fără detectarea incorectă a șoarecilor care au supraviețuit. În comparație, o reducere a T × BW la mai puțin de 60% din valorile inițiale în ziua 7 după infecție ar fi detectat 3 din 4 șoareci care au murit în cele din urmă și au detectat incorect 1 din 7 șoareci care au supraviețuit.

morții

Șoareci obezi și normali C57BL/6J infectați cu tulpina PR8 a virusului gripal. Șoarecii C57BL/6J au fost hrăniți fie cu o dietă normală (4,5% grăsimi; n = 10), fie cu o dietă bogată în grăsimi (60% grăsimi; n = 9) de la 6 la 34 săptămâni. Șoarecii au fost apoi inoculați cu 25 uL de lichid alantoic conținând 1 × 10 3 tulpina PR8 a virusului gripal TCID50 (1/3 din doza MLD50 pentru șoarecii BALB/cByJ). *, P Figura 4). Temperatura și T × BW au fost informative cu privire la diferențierea șoarecilor care au trăit și au murit, în timp ce greutatea corporală nu a fost (Figura 4). O reducere a T × BW la 85% sau mai puțin din valorile inițiale în ziua 1 după infecție ar fi detectat toți cei 9 șoareci care au murit în cele din urmă și au detectat incorect 3 din 15 șoareci care au supraviețuit.

Mai multe dintre experimentele care au produs datele analizate aici au fost studii preliminare de determinare a dozei care au evaluat rezultatele în rândul șoarecilor care au primit doze diferite ale aceluiași agent. Numerele testate la fiecare doză în aceste studii nu au fost suficiente pentru a permite compararea în doze. Cu toate acestea, având în vedere că doza infecțioasă este, fără îndoială, cel mai bun predictor al morții după provocarea infecțioasă, testul ideal pentru verificarea acestor factori ar fi un studiu de urmărire utilizând o doză LD50. Astfel de studii ar fi importante pentru validarea atât a markerilor de determinare a dozei, cât și a criteriilor finale dacă modelul a fost destinat utilizării repetate (de exemplu, pentru screeningul terapeutic).

Luate împreună cu lucrările anterioare, constatările noastre subliniază importanța adaptării cu atenție a selecției markerilor de puncte finale la modelul experimental specific și validarea acestor markeri pentru acel model. Determinarea obiectivelor umane pentru animalele de laborator este din ce în ce mai importantă pentru IACUC și agențiile de reglementare. Prezentul studiu și munca noastră anterioară 11 oferă o strategie simplă pentru identificarea markerilor de deces eventual la șoareci. În lumina datelor noastre, sugerăm că anchetatorii care efectuează studii similare folosind alte modele de șoareci de boli infecțioase evaluează abordarea noastră în studiile lor în curs și raportează descoperirile lor comunității științifice.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută parțial de granturile NIH K26-RR17543 și R01-NS40220 și de către Școala de Medicină a Universității Southern Illinois. Mulțumim Christine Bosgraaf și Lisa Cox pentru că au oferit asistență tehnică excelentă.