Abstract

Compușii chimici din saliva cel mai probabil asociați cu obezitatea sunt identificați printr-o analiză metabolomică a salivei întregi și a probelor de plasmă de la 68 de copii (10 ani) care au fost, de asemenea, evaluați pentru roșeața lor gingivală.

plasmatici

Rezultate Prin analiza metabolomică, 119 compuși au fost găsiți numai în salivă, 210 numai în plasmă și 126 în ambele. Cei mai comuni metaboliți plasmatici au fost lipidele. Cei mai comuni metaboliți ai salivei au fost peptidele. Aminoacizii și metaboliții lor au fost obișnuiți în ambele probe.

Indicatorii surogat au fost identificați prin calcularea corelațiilor dintre salivă și plasmă. 29 din cele 126 găsite atât în ​​salivă cât și în plasmă au avut o corelație pozitivă semnificativă și doar 4 dintre acestea (urat, creatinină, pipecolat și hidroxiprolină) au fost asociate cu obezitatea ca potențiali biomarkeri surogat. Toxina uremică N1-Metil-2-piridonă-5-carboxamidă (2PY) a fost, de asemenea, crescută în saliva copiilor obezi. 21 de substanțe biochimice au fost crescute atât în ​​obezitate, cât și în gingivită, sugerând că unele căi biochimice pentru gingivită și obezitate sunt partajate.

Dintre metaboliții găsiți doar în salivă, 35 au fost asociați cu obezitatea (tuburi de stocare p ® 2D cu coduri de bare ScrewTop ®, Thermo Fisher Scientific Inc., Hudson, New Hampshire) și citite de un cititor de coduri de bare (Thermo Scientific VisionMate ® ST Barcode Reader, Thermo Fisher Scientific Inc., Hudson, New Hampshire), după care numărul participantului a fost legat de numărul eșantionului.

Sângele a fost preluat de un flebotomist din artera cubitală mediană (BD Hemogard plus, K2 BD367863, capac de lavandă), centrifugat 10 minute la 2.000 x g într-o centrifugă refrigerată. Ambele probe de salivă și plasmă au fost depozitate la -80 ° C până la testare.

Evaluări clinice

Toate evaluările clinice au fost efectuate de examinatori instruiți. Înălțimea a fost măsurată cu un stadiometru, iar greutatea a fost măsurată cu un cântar de baie calibrat. Tensiunea arterială și ritmul cardiac au fost măsurate printr-o citire automată a manșetei după ce copiii au stat liniștiți timp de 10 minute. Măsurătorile dentare au fost obținute folosind un scaun dentar portabil pediatric, lumina intraorală și oglinda bucală. Gingivita a fost evaluată prin numărarea numărului de situsuri gingivale roșii (mezial, bucal, distal și lingual al fiecărui dinte) de către personalul dentar. Carierea dentară a fost evaluată prin numărarea numărului de dinți (atât de foioase, cât și permanenți) care au avut o carie vizibilă sau au fost umpluți. Nici sondele dentare, nici radiografiile nu au fost utilizate în acest studiu.

Analiza metabolomică

Au fost testate alicote de 120 μL de supernatante de salivă și de probe de plasmă de la fiecare participant. Cantitățile relative ale fiecărui metabolit au fost obținute prin integrarea vârfurilor detectate pe o platformă de profilare metabolică nedestinată (Metabolon®, Durham, Carolina de Nord) folosind cromatografie lichidă de înaltă performanță/spectrometrie de masă tandem (HPLC-MS/MS și cromatografie de gaze-spectrometrie de masă (GC- MS) pentru speciile volatile [2] Compușii au fost identificați prin potrivirea timpilor de retenție cromatografică și a semnăturilor de fragmentare spectrală de masă cu datele bibliotecii de referință create din standarde autentice.

Analiza datelor

Toate cele 455 de produse biochimice identificate în salivă, în plasmă sau în ambele au fost supuse la trei niveluri de analize. Prima analiză a fost să se determine dacă un biochimic al salivei ar putea fi un surogat plasmatic. A doua analiză a fost pentru a determina dacă un produs biochimic prezice obezitatea. A treia analiză a fost de a determina un biochimic care prezice gingivita, hipertensiunea sau caria dentară. Informațiile pacienților și datele cantitative ale acestui studiu sunt furnizate în tabelele suplimentare. Tabelul S1 conține datele categorice clinice. Tabelul S2 conține datele pentru salivă și Tabelul S3 datele pentru plasmă. Numai acele produse biochimice cu valori p pentru obezitate ≤ 0,01 au fost reținute în tabele din textul principal.

La nivel primar, a fost efectuată o analiză pentru a determina corelația dintre nivelurile de salivă și nivelurile plasmatice, identificând acele produse biochimice din salivă care pot fi direct legate de plasmă. Această analiză, dacă este pozitivă și semnificativă, ar indica dacă există un coeficient de distribuție pozitiv între compartimentele de salivă și plasmă. Dacă este negativ sau nesemnificativ, probabil nu există nicio relație între nivelurile de salivă și plasmă, astfel încât este puțin probabil ca aceste variabile să înlocuiască candidații variabili. Aceasta presupune, totuși, că concentrația atât în ​​salivă cât și în plasmă se încadrează în sensibilitatea de măsurare a metodei spectrometrice de masă.

Pentru nivelul secundar, capacitatea de a prezice dacă un subiect este obez este testată prin statistici non-parametrice (testul U Mann-Whitney). Dacă această măsură a fost semnificativă, biochimicul a fost identificat ca un potențial biomarker pentru obezitate. Dacă nu, a fost aruncat. Această analiză a fost mărită prin determinarea ariei de sub curba de funcționare a receptorului (AUROC). Această măsură este o măsură sumară a acurateței unui test de diagnostic cantitativ care poate fi interpretat ca sensibilitate medie pentru toate valorile posibile ale specificității [3]. Valorile pentru AUROC au fost determinate din datele metabolomice utilizând software-ul MetaboAnalyst 3.0 (http://www.metaboanalyst.ca/).

Pentru al treilea nivel, abilitatea de a prezice dacă un subiect are gingivită, carie dentară sau hipertensiune arterială a fost testată prin statistici non-parametrice. Rezultatele indică dacă oricare dintre substanțele biochimice (fie în salivă, fie în plasmă) au fost potențiali biomarkeri pentru aceste afecțiuni și dacă au intrat în conflict cu identificarea obezității.

Evaluare clinică: Un copil cu obezitate a fost definit ca având ≥95 a percentilă în indicele de masă corporală (IMC) (https://nccd.cdc.gov/dnpabmi/Calculator.aspx). Un copil cu gingivită a fost definit ca fiind cel cu procentul mai mare decât medianul siturilor gingivale roșii (10,6% din siturile roșii). Copiii cu carie dentară au fost definiți ca fiind cei cu orice carie vizibilă pe orice dinte. Hipertensiunea a fost definită ca având tensiune arterială sistolică ≥ 130 mmHg.

rezultate si discutii

Demografia pacientului

Dintre cei 68 de copii evaluați (Tabelul 1), 22 erau obezi (16 bărbați, 6 femei) și 46 nu erau obezi (6 bărbați, 40 femei) cu o vârstă medie de 10,7 ± 0,2 ani. IMC mediu, circumferința taliei, greutatea corporală, roșeața gingivală, înălțimea, vârsta și tensiunea arterială sistolică a copiilor obezi au fost semnificativ mai mari la copiii obezi. Nu s-a observat nicio diferență în ceea ce privește tensiunea arterială diastolică sau caria dentară.

Caracteristicile antropomorfe și clinice ale populației studiate grupate după obezitate. Valorile listate sunt media ± eroare standard. valorile p se referă la o analiză prin testul t.

Distribuția produselor biochimice

Un număr combinat de 455 biochimice unice au fost identificate din probe de supernatant de plasmă și salivă centrifugată (Figura 1). 119 (26%) au fost detectate numai în salivă, 210 (46%) au fost găsite doar în plasmă și 126 (28%) au fost găsite atât în ​​plasmă, cât și în salivă.

Majoritatea substanțelor biochimice frecvente între salivă și plasmă au fost aminoacizii și metaboliții lor (Figura 1). În salivă, peptidele au fost cele mai frecvent găsite produse biochimice. În plasmă, cele mai frecvente au fost lipidele. 109 (77%) specii de lipide găsite în plasmă nu au fost detectate în salivă și 48 (91%) din peptidele găsite în salivă nu au fost detectate în plasmă.

Analiza obezității, gingivitei, cariilor și hipertensiunii arteriale a demonstrat că obezitatea a avut cea mai mare reprezentare atât a metaboliților salivari, cât și a celor plasmatici (Figura 2). Obezitatea a fost asociată semnificativ (p ≤ 0,01) cu 39 de produse biochimice atât prin analiza salivară (Tabelul 3), cât și prin 64 prin analiza plasmatică (Tabelul 4).

Biochimice surogate

Analiza salivei și a plasmei a identificat 29 de produse biochimice cu corelație pozitivă semnificativă (Tabelul 2). Nivelurile de salivă din primele patru (pipecolat, creatinină, trans-4-hidroxiprolină și urat) au fost, de asemenea, semnificativ asociate cu obezitatea. Analizele de regresie ale acestor produse biochimice (Figura 3) arată că acești patru metaboliți au fost corelați semnificativ.

Pipecolate este un metabolit al lizinei care se găsește în urina umană, în plasmă, în salivă și în LCR, care provine probabil fie din alimentele consumate, fie din metabolismul bacterian. În studiul nostru, o asociere semnificativă a fost găsită doar în salivă. Studii recente sugerează că acidul pipecolic plasmatic, în special izomerul D, provine în principal din catabolismul lizinei dietetice de către bacteriile intestinale, mai degrabă decât prin aportul direct de alimente. La bacterii, pipecolatul este implicat în sinteza antibioticelor pentru unele specii [4]. Este crescut în plasma pacienților cu sindrom Zellweger și în boala hepatică cronică [5]. Pipecolatul a fost, de asemenea, un indicator semnificativ al gingivitei (Tabelul 2).

Biochimice (n = 29) cu corelație semnificativă (p ≤ 0,01) între salivă și plasmă sortate în ordinea valorii p pentru predicția obezității p (Obezitate) de biochimice ale salivei. N este numărul de copii la care a fost detectat produsul biochimic. Corelația p este valoarea p a unei corelații între valorile salivei și ale plasmei. AUROC este zona de sub curba ROC care prezice obezitatea ca predictor univariat. Valoarea de pliere este raportul dintre media pentru copiii obezi împărțit la media pentru copiii non-obezi. Sunt incluse valorile P pentru predicția gingivitei, a cariilor și a hipertensiunii arteriale în salivă și plasmă.

Creatinină este un metabolit al fosfatului de creatinină care este eliberat din mușchi la o rată relativ constantă. Nivelurile de creatinină din sânge (100 mM = 1 mg/dL) sunt importante din punct de vedere clinic, deoarece sunt utilizate pentru a estima rata filtrării glomerulare. Dintre biomarkerii din studiul nostru, creatinina a avut cea mai mare salivă: corelația plasmatică măsurată (0,48) sugerând că concentrațiile de salivă ale acestui metabolit au fost un surogat pentru nivelurile plasmatice. La copiii obezi s-au observat niveluri salivare semnificativ crescute de creatinină (Tabelul 2), ceea ce sugerează și o posibilă asociere cu afecțiuni renale [6]. Datele din Tabelul 2 și Figura 3 sugerează că creatinina salivară poate fi utilizată ca variabilă surogat (AUROC = 0,73) pentru creatinina din sânge și ca indicator al dezvoltării obezității.

Trans-4-hidroxiprolină în salivă este adesea asociată cu digestia enzimatică a colagenului în gingivită și boala parodontală. Asociația găsită în acest studiu sugerează totuși o posibilă modulare a obezității. Datele noastre nu indică nicio asociere semnificativă. Deși nivelurile trans-4-hidroxiprolinei din salivă și plasmă au fost corelate pozitiv (p = 0,002, Tabelul 2), numai nivelurile de salivă au indicat obezitatea (p = 0,003 pentru salivă și p = 0,61 pentru plasmă) sugerând o interacțiune între afecțiunile inflamatorii de obezitate și gingivită. Nivelurile plasmatice ale trans-4-hidroxiprolinei nu au fost semnificativ asociate cu obezitatea.

Urate este în general recunoscut ca un marker al adipozității [7], obezității și filtrării glomerulare [8]. Alții au indicat că este un marker de inflamație, disfuncție endotelială și măsuri crescute ale sindromului metabolic [9]. Mulți consideră că are un rol cauzal în dezvoltarea diabetului datorită rolului său în metabolismul fructozei [10]. În cercetarea noastră, oferim dovezi că uratul salivar este un surogat al uratului plasmatic (Tabelul 3). Rezultatele noastre indică, de asemenea, o valoare corectă de predicție univariată (AUROC = 0,68) pentru obezitate.

Biochimice (n = 21) în salivă asociate atât cu obezitatea, cât și cu gingivita, sortate după valoarea p pentru obezitate. Compartiment: S = numai salivă, B = atât plasmă, cât și salivă. Corelația este doar pentru compartimentul B. Rangul se bazează pe valoarea minimă p pentru obezitate și pentru gingivită.

Biochimice salivare asociate atât cu obezitatea, cât și cu gingivita

Douăzeci și unu de substanțe biochimice salivare au fost semnificativ legate atât de obezitate, cât și de gingivită (Tabelul 3), sugerând că pot exista căi biochimice comune între aceste două boli inflamatorii. Examinarea compartimentelor de produse biochimice din tabelul 2 indică faptul că, cu o singură excepție (pipecolat), toate produsele biochimice se găsesc fie numai în salivă (Compartiment = S), fie nu se corelează semnificativ între salivă și plasmă. Prin urmare, toate produsele biochimice asociate atât cu obezitatea, cât și cu gingivita au fost în esență limitate la salivă.

Hidroxifenilactat apare pe locul doi atât în ​​obezitate, cât și în salivă. În biologia mamiferelor, acesta este un metabolit al tirozinei, dar este, de asemenea, sintetizat ca formă D de către bacteriile orale din compuși fenolici.

Alantoina apare pe locul patru în obezitate și pe locul trei în gingivită și este produsă de animale, plante și bacterii. Alantoina este un produs al metabolismului purinic considerat de unii ca o măsură a stresului oxidativ [11].

Biochimice se găsesc numai în salivă

Biochimice identificate ca potențiali biomarkeri pentru obezitate se găsesc numai în salivă (n = 35) sortate după capacitatea de a identifica copii obezi (p≤ 0,01). Aceste date includ cele găsite numai în salivă (compartiment = S) și cele din ambele (compartimentul B) a căror corelație salivă/plasmatică este ≤0,01. Alte variabile sunt cele definite în Tabelul 2.

Biochimicele salive asociate semnificativ cu obezitatea (n = 35) sunt enumerate în Tabelul 4. Dintre aceste biochimice asociate obezității, 21 au fost, de asemenea, crescute semnificativ la copiii cu gingivită. Dintre cele 126 de produse biochimice găsite atât în ​​salivă cât și în plasmă, 35 + 4 = 39 au fost găsite semnificativ (p 0.3)). Peptida cea mai predictivă (p = 0,002) a obezității a fost ciclo (glife) (Tabelul 3).

Biochimice găsite numai în plasmă

Serotonina reducerea plasmei a fost extrem de semnificativă la copiii obezi. Depresia și medicamentele antidepresive sunt ambele asociate cu un risc crescut de obezitate probabil datorită unei reduceri a serotoninei sau a transportatorului de serotonină [24, 25].

Serotonina redusă a fost găsită în sângele din cordonul ombilical, unde această reducere a fost asociată cu creșterea rapidă în greutate postnatală [26]. Înțelegerea funcției serotoninei a fost extinsă în general pentru a include obezitatea și diabetul [25].

Lipide saturate (caproat, heptanoat caprilat, pelargonat, caprat, laurat, miristat, nonadecoanoat) în plasmă au fost reduse semnificativ în ceea ce privește obezitatea (tabelele 4 și 5). Această observație diferă de cea raportată de obicei la adulți. Obezitatea la adulți și diabetul de tip 2 este în general asociată cu o creștere a acizilor grași fără plasmă [27].

Biochimice identificate ca potențiali biomarkeri numai în plasmă (n = 64) sortate după capacitatea de a identifica copii obezi (obezitate p≤ 0,01). Compartimentul este B = atât salivă cât și plasmă, P = plasmă singură. Alte variabile sunt cele descrise în legenda Tabelului 2.

Biochimicele plasmatice legate semnificativ de obezitate (n = 64) sunt enumerate în Tabelul 5.

Pe baza unei limite semnificative de p≤0,01, au existat 64 de produse biochimice în plasmă care au identificat copii obezi (Tabelul 4). Cei mai sensibili biomarkeri din plasmă au fost serina (reducere de 0,79 ori) și serotonina (reducere de 0,45 ori) ambii cu un AUROC de 0,84.

Cea mai semnificativă modificare a substanțelor biochimice asociate cu obezitatea în plasmă a fost reducerea serotoninei (Tabelul 5) cu obezitate.

Gamma-glutamilfenilalanină creșterea cu obezitatea sugerează o creștere a activității gamma-glutamil transferazei (GGT, E.C. 2.3.3.2). GGT a fost folosit de mult timp pentru evaluarea bolilor hepatice și este, de asemenea, asociat cu diabetul [28]. Al treilea cel mai puternic biochimic, piperină este unul dintre alcaloizii care îi conferă piperului pungența.

Aminoacizi și derivați de aminoacizi au fost frecvente (n = 22) în produsele biochimice care prezic obezitatea. Trei aminoacizi cu lanț ramificat (valină, izoleucină, leucină) și doi aminoacizi aromatici (tirozină și fenilalanină) a crescut semnificativ în plasma copiilor obezi. Analiza longitudinală a adulților în studiul Framingham Heart [29], demonstrează că nivelurile plasmatice crescute ale acestor cinci aminoacizi stimulează eliberarea insulinei și prezic dezvoltarea viitoare a diabetului cu până la 12 ani înainte de apariția diabetului. Doi aminoacizi (serină și glicină) a scăzut semnificativ odată cu obezitatea. Reducerea serinei cu obezitate a fost cea mai puternică modificare biochimică asociată a probelor de plasmă (p = 0,00001, ASC = 0,84)), care a fost raportată și de alți investigatori [30].

Biochimice de interes special

Limitările acestui studiu includ metoda analizei metabolomice nevizate. Această metodă nu oferă o estimare a sensibilității testului sau a concentrațiilor absolute pentru biochimice individuale, astfel încât să existe întotdeauna un factor necunoscut asociat cu această analiză. Aceasta nu este o limitare a spectrometriei de masă, ci o limitare a metodei nevizate care a furnizat doar cantități relative de 455 biochimice, dar nu au valori de concentrație absolute. Identificarea unui subgrup de 35 + 4 = 39 substanțe biochimice salivare potențial importante face totuși mai fezabilă viitoarea analiză a biochimicelor promițătoare prin eliminarea substanțelor biochimice care nu par a fi legate de obezitate.

O altă limitare este problema analizelor multiple. Numai acele produse biochimice cu valori p pentru obezitate ≤ 0,01 au fost reținute în tabelele de text. Deoarece valoarea p corectată de Bonferroni de 0,05 pentru 455 comparații este de 0,0001, adevărata semnificație statistică a avut loc numai pentru pipecolat (Tabelul 2), fosfat și 3-4 hidroxifenil lactat (Tabelul 3) și serină (Tabelul 5). Scopul acestei analize este de a identifica acele substanțe biochimice din salivă care sunt cel mai probabil asociate cu obezitatea și cel mai puțin asociate cu alte afecțiuni sistemice comune ale bolii și nu pentru a dovedi capacitatea de diagnostic clinic. Analiza reală a potențialului de diagnosticare va necesita o abordare direcționată, cu un număr mult mai mic de produse biochimice testate într-o cohortă mai mare.

Concluzii

Saliva este capabilă să ofere informații considerabile legate de dezvoltarea obezității la copii. Deoarece nu pare, totuși, să fie adaptat la estimarea multor metaboliți solubili în grăsimi din plasmă. Majoritatea metaboliților care se găsesc numai în salivă provin probabil din metabolismul bacterian. Uratul salivar poate fi un estimator util al consumului de fructoză și al riscului de sindrom metabolic. Creșterea creatininei salivare și a 2PY sugerează o posibilă boală renală timpurie la copiii obezi. Nivelurile plasmatice ale multor metaboliți la copiii obezi (nu diabetici) au diferit în aceeași direcție ca și adulții cu diabet de tip II. În cele din urmă, conținutul de fosfat salivar ar putea reflecta evoluția obezității la copii. Rezultatele analizei noastre metabolomice nețintite constituie baza pentru alte studii specifice pentru a identifica cu precizie rolurile și reglarea factorilor identificați în obezitate și boli metabolice, în general.