Roluri Conceptualizare, Curarea datelor, Scriere - schiță originală, Scriere - recenzie și editare

limitat

Laboratorul de afiliere de biochimie nutrițională, Universitatea Nagoya, Nagoya, Japonia

Roluri Arhivarea datelor, Scriere - revizuire și editare

Departamentul de afiliere al științei nutriționale, Universitatea de Arte și Științe din Nagoya, Nisshin, Japonia

Roluri Curarea datelor

Adresa actuală: Facultatea de Știința Alimentelor și Nutriție, Universitatea Beppu, Beppu, Japonia

Facultatea de afiliere a științei educației și bunăstării, Universitatea Oita, Oita, Japonia

Roluri Curarea datelor

Departamentul de afiliere al științei nutriționale, Universitatea Nagoya de Arte și Științe, Nisshin, Japonia

Roluri Curarea datelor

Facultatea de afiliere a științei educației și bunăstării, Universitatea Oita, Oita, Japonia

Roluri Conceptualizare, organizarea datelor, achiziționarea de fonduri, scriere - revizuire și editare

Laboratorul de afiliere de biochimie nutrițională, Universitatea Nagoya, Nagoya, Japonia

  • Shumin Soare.,
  • Fumiaki Hanzawa,
  • Miki Umeki,
  • Saiko Ikeda,
  • Satoshi Mochizuki,
  • Hiroaki Oda

Cifre

Abstract

Citare: Sun S, Hanzawa F, Umeki M, Ikeda S, Mochizuki S, Oda H (2018) Hrănirea limitată în timp suprimă acumularea excesivă de plasmă și lipide hepatice induse de zaharoză la șobolani. PLOS ONE 13 (8): e0201261. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0201261

Editor: Marcia B. Aguila, Universidade do Estado do Rio de Janeiro, BRAZILIA

Primit: 26 aprilie 2018; Admis: 11 iulie 2018; Publicat: 15 august 2018

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Această lucrare este susținută de Granturi în ajutor pentru cercetare științifică de la Societatea Japoneză pentru Promovarea Științei (http://www.jsps.go.jp/english/) (Destinatar: HO; Nr.21658052; Nr. 25292069; Nr. 16H04922). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Sunt necesare studii suplimentare pentru a descoperi mecanismul modului în care zaharoza ar putea contribui la apariția sindromului metabolic la nivel molecular. În prezent, sunt necesare metode eficiente de prevenire sau ameliorare pentru sindromul metabolic indus de zaharoză. Am demonstrat anterior că un program de hrănire suprimat, cu diete bogate în colesterol la fiecare 6 ore, duce la șobolani care dezvoltă hipercolesterolemie și un ceas hepatic perturbat [11]. Întreruperea oscilațiilor circadiene la șoarecii mutanți Clock duce la atenuarea robustă a ritmului de hrănire și a sindromului metabolic [12]. Mai mult, alimentarea cu timp limitat a unei diete bogate în grăsimi timp de 8 ore pe zi la șoareci a îmbunătățit ritmul metabolic și a conferit protecție împotriva bolilor metabolice, evidențiind astfel importanța atât a stării de nutrienți, cât și a modelului de hrănire în homeostazia metabolică [13]. De asemenea, efectele benefice ale regimului alimentar restricționat în timp în diferite condiții alimentare, inclusiv dietele bogate în grăsimi, bogate în fructoză și bogate în grăsimi plus fructoză, au fost verificate în modelele de șoareci [14].

Regimul de hrănire limitat la timp la modelele de obezitate de șobolani Zucker, cu o dietă normală de chow, a reușit să reducă creșterea în greutate corporală [15]. Aici, pentru a evalua efectele hrănirii restricționate în timp asupra ameliorării sindromului metabolic indus de zaharoză la șobolanii normali genetic, cum ar fi metabolismul lipidic anormal, am stabilit un program de hrănire prin restrângerea dietei ridicate de zaharoză (HSD) la 12 ore faza activă a șobolanilor masculi Wistar. Șobolanii pot fi modele animale mai potrivite decât șoarecii pentru a investiga bolile metabolice ale oamenilor, datorită dimensiunii corpului lor de aproximativ 10 ori mai mari și a stărilor de metabolism energetic mai stabile comparativ cu cele de la șoareci. Am constatat că hrănirea limitată în timp a HSD a suprimat în mod eficient excesul de acumulare de lipide indusă de zaharoză atât în ​​sânge, cât și în ficat, în comparație cu șobolanii hrăniți HSD ad lib., Fără a modifica semnificativ oscilațiile circadiene ale expresiei genei ceasului în ficat.

Materiale și metode

Animale, program de hrănire și diete

ZT: zeitigeber time.

Analiza biochimică

Concentrațiile de trigliceride din sânge, colesterol, glucoză, acid gras neesterificat (NEFA) și acid biliar au fost măsurate folosind truse comerciale (triglicerid E-test, T-colesterol E-test, glucose CII-test, NEFA-C test și TBA- test; Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonia). Nivelurile de insulină și corticosteron au fost determinate folosind truse ELISA (trusa ELISA pentru insulină de șobolan, Institutul de Științe Biologice Morinaga, Yokohama, Japonia; trusă ELISA pentru corticosteron, Enzo life sciences, NY).

Aproximativ 2,5 g de ficat au fost omogenizate și lipide extrase, urmând metoda descrisă de Folch și colab. [16]. Lipidele totale din ficat au fost determinate gravimetric. Concentrațiile de trigliceride hepatice, colesterol și fosfolipide din extracte au fost măsurate folosind truse comerciale (fosfolipide C-test: Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonia).

Analiza expresiei genelor

ARN total a fost extras din 500 mg de țesut hepatic al fiecărui șobolan, urmând metoda lui Chomczynski și Sacchi [17]. Calitatea ARN a fost confirmată de blotarea nordică. Tratamentul cu dezoxiribonuclează (DNază) a fost efectuat cu DNază fără ribonuclează (RNază) (Promega, Wisconsin) și inhibitor de RNază (Takara Bio, Japonia). ADN-ul complementar (ADNc) a fost sintetizat cu ARN tratat cu 2 μg DNase prin kit de transcriere inversă (trusă de capacitate mare ARN-ADNc, Applied Biosystems, CA). ADNc a fost utilizat pentru a determina nivelurile de ARN mesager (ARNm) prin analiza cantitativă în timp real a reacției în lanț a polimerazei (PCR în timp real). Nivelul de ARNm APOE nu a fost afectat de niciun tratament în acest studiu și a fost utilizat ca standard de normalizare. Secvențele seturilor de exemple utilizate sunt prezentate în tabelul S1.

Analiza temperaturii corpului

Temperaturile corpului șobolanilor au fost înregistrate la fiecare 10 minute de la ziua 0 până la sfârșitul experimentului. Programul Rh Manager (laboratoarele KN, Osaka, Japonia) a fost utilizat pentru a analiza variațiile de temperatură ale corpului. Deși variațiile au fost monitorizate la fiecare 10 minute, cele la fiecare 90 de minute au fost prezentate în rezultate.

Statistici

La sfârșitul experimentului, probele au fost colectate pe tot parcursul zilei pentru a evalua modificările diurne ale parametrilor serici și ale expresiilor genice hepatice. Datele afișate în tabele și cifre reprezintă media ± eroare standard a mediei (SEM). Creșterea în greutate corporală, aportul de alimente, greutatea ficatului, greutatea țesutului adipos epididimal, lipidele hepatice, parametrii serici și rezultatele PCR în timp real au fost analizate cu ANOVA bidirecțională. Parametrii plasmatici au fost analizați cu măsuri repetate în două direcții ANOVA. Pentru variațiile de temperatură a corpului, măsurile repetate în două direcții ANOVA au fost urmate de analiza JTK_CYCLE [18] pentru a determina fazele și amplitudinile fiecărui șobolan. În cele din urmă, ANOVA bidirecțională a fost efectuată pentru a analiza fazele și amplitudinile între patru grupuri. Procentul consumului de alimente în perioada de lumină (sau întuneric) a fost analizat prin testul t Student. Rezultatele statistice sunt prezentate în tabelele 2 și tabelele S2 - S6. Toate analizele statistice au fost efectuate cu IBM SPSS Statistics (Versiunea 22) și R studio.

Rezultate

Greutatea corporală, aportul de alimente și greutățile țesuturilor

Creșterea în greutate corporală nu a avut nicio modificare evidentă în rândul grupurilor CDA, HSDA și HSDR, în timp ce grupul CDR a prezentat o creștere a greutății corporale reduse (Tabelul 2). Aportul total de alimente nu s-a modificat între cele patru grupuri (Tabelul 2). Cu toate acestea, s-a observat o modificare a raportului consumului de alimente zi/noapte între grupurile CDA și HSDA. Deoarece șobolanii sunt animale nocturne, cea mai mare parte a consumului lor de hrană este în perioada întunecată (ZT12-ZT24) (Fig. 2A). Am măsurat raportul aportului alimentar în perioada de lumină-întuneric a grupurilor hrănite ad lib. (Fig. 2). Deși șobolanii HSDA au prezentat un consum aproximativ similar de alimente ca șobolanii CDA (Tabelul 2), aceștia din urmă și-au completat 24% din consumul zilnic de alimente în faza inactivă (perioadă ușoară), în timp ce șobolanii HSDA aveau doar 17% în acel moment (Fig. 2B). Acest rezultat a indicat un potențial rol al HSD în modificarea ritmului de hrănire diurnă la șobolani. Aportul total de alimente nu a arătat nicio diferență semnificativă între hrănirea limitată în timp și ad lib. hrănirea șobolanilor (Tabelul 2), indicând prin urmare că regimul de hrănire nu a modificat cantitatea de aport alimentar. Șobolanii au hrănit un HSD, fie ad lib. sau cu restricție de timp, afișat greutăți hepatice evident crescute (Tabelul 2). Cu toate acestea, greutățile țesutului adipos epididimal nu au fost diferite între grupuri (Tabelul 2).

(A) Aportul de hrană în perioada de lumină/întuneric a fost măsurat respectiv de la d18 la d20, iar șobolanii de hrănire restricționați în timp nu au acces la alimente în perioadele de lumină. Valorile sunt medii ± SEM, n = 20. Aportul alimentar din perioada întunecată a fost analizat prin ANOVA cu două căi. 0,05 reprezintă modificări semnificative, iar NS înseamnă nesemnificativ. Aportul de hrană în perioada de lumină a fost analizat prin testul t Student și *** a indicat că valoarea diferă semnificativ (p Fig 3. Alimentarea limitată în timp a HSD a afectat modelul de oscilare a temperaturilor corpului la șobolani.

Temperaturile corpului au fost înregistrate la fiecare 10 minute pe parcursul întregului studiu de 4 săptămâni și aici s-au calculat medii la fiecare 90 de minute în ultimele două zile experimentale. Valorile sunt medii ± SEM. Au fost efectuate mai întâi măsurători repetate în două direcții ANOVA ale temperaturii corpului între fiecare două grupuri și, de asemenea, între 4 grupuri. Analiza JTK_cycle a fost aplicată pentru a determina fazele și amplitudinea temperaturilor corpului la fiecare șobolan (media ± SEM a fiecărui grup a fost prezentată în tabelul S2). Apoi, a fost efectuat ANOVA cu două căi pentru a analiza faza și amplitudinile în cadrul a patru grupuri. Rezultatele statistice ale JTK_cycle și ANOVA cu două căi sunt prezente în tabelul S2. 0,05 reprezintă modificări semnificative, iar NS înseamnă nesemnificativ. (A) Controlul dietei amidonului ad lib. (CDA, n = 4 pentru fiecare punct de date) și dietă bogată în zaharoză ad lib. (HSDA, n = 3 pentru fiecare punct de date). (B) Controlul dietei amidonului ad lib. (CDA, n = 4 pentru fiecare punct de date) și controlul alimentării cu amidon restricționat în timp (CDR, n = 4 pentru fiecare punct de date). (C) Dieta bogată în zaharoză ad lib. (HSDA, n = 3 pentru fiecare punct de date) și alimentație cu zahăr ridicat în timp limitat (HSDR, n = 3 pentru fiecare punct de date).

Parametrii sângelui și lipidele hepatice

Pentru a determina dacă hrănirea cu timp restricționat a HSD previne hiperlipidemia la șobolani, au fost măsurate nivelurile trigliceridelor plasmatice și ale colesterolului. Nivelurile trigliceridelor plasmatice s-au dovedit a fi crescute continuu în următoarele patru săptămâni la toți șobolanii și au fost semnificativ crescute de HSD comparativ cu cele de la șobolanii CDR (Fig. 4A și S3 Tabel). Cu toate acestea, deși hrănirea cu timp limitat de HSD (HSDR) a atenuat în mod clar creșterea trigliceridelor, acestea au fost menținute la niveluri mai ridicate comparativ cu cele din grupurile CD (Fig. 4A și S3 Tabel). Concentrația totală de colesterol în grupurile HSD a fost crescută, așa cum se vede în Fig 4B. În timp ce hrănirea cu timp limitat a CD a scăzut semnificativ nivelul colesterolului, șobolanii HSDR nu au prezentat nicio scădere semnificativă (Tabelul 4B și S3). Nivelurile de glucoză plasmatică nu au fost influențate de HSD, alimentate fie libere. sau într-o manieră limitată în timp, pe întreaga perioadă experimentală (Tabelul 4C și S3).

Variațiile trigliceridelor (A), ale colesterolului (B) și ale glucozei (C) măsurate în zilele 0, 1, 3, 7, 14 și 24 sunt prezentate în plasmă (colectate la ZT5 după 4 ore post). Valorile sunt medii ± SEM, n = 20. Rezultatele statistice ale măsurilor repetate în două direcții ANOVA sunt indicate în tabelul S3. 0,05 reprezintă modificări semnificative, iar NS înseamnă nesemnificativ.

Apoi, am măsurat variațiile diurne ale insulinei, corticosteronului, acidului gras neesterificat (NEFA) și acizilor biliari. Serul a fost colectat în cinci puncte de timp diferite (sângele a fost colectat atunci când șobolanii au fost sacrificați) până în ultima zi. Insulina răspunde la metabolismul glucidic-lipidic și la hormonul glucocorticoid, corticosteronul (cortizolul la om), care are un rol în oscilațiile circadiene și în metabolismul lipidelor [19-22]. Nivelurile de insulină au fost reduse în grupurile HSD la ZT18 și ZT22. Și la ZT8, șobolanii CDA au prezentat niveluri mai ridicate de insulină decât cele CDR și HSDA (Fig. 5A). Corticosteronul nu a prezentat nicio diferență semnificativă între grupuri (Fig. 5B). La ZT18, NEFA a fost crescut cu HSD și suprimat semnificativ la șobolanii HSDR (Fig. 5C). HSD a crescut semnificativ nivelurile de acid biliar seric în faza inactivă (perioadă ușoară, la ZT2 și ZT8) (Fig 5D), deși hrănirea limitată în timp nu a modificat creșterea acidului biliar indusă de HSD.

Variațiile zilnice ale insulinei din sânge (A), corticosteronului (B), acidului gras neesterificat (NEFA) (C) și acizilor biliari (D) la sfârșitul experimentului sunt prezentate aici. Valorile sunt medii ± SEM, n = 4 la fiecare punct de date. Rezultatele statistice ale ANOVA bidirecțional sunt indicate în tabelul S4. 0,05 reprezintă modificări semnificative, iar NS înseamnă nesemnificativ. Atunci când interacțiunea este semnificativă, s-a efectuat testul t Student utilizând pătratul mediu rezidual: *** a indicat că valorile diferă semnificativ (p ### a indicat că valorile diferă semnificativ (p §§§ a indicat că valorile difereau) semnificativ (p ¶¶¶ a indicat că valorile diferă semnificativ (p Fig. 6. Regimul de hrănire restricționat în timp a suprimat acumularea de lipide hepatice indusă de HSD.

Sunt prezentate cantitățile lipidice totale hepatice (A), trigliceride (B), colesterol (C) și fosfolipide (D). Valorile sunt medii ± SEM, n = 20. În tabelele rezultatelor ANOVA bidirecționale, 0,05 reprezintă modificări semnificative, iar NS înseamnă nesemnificativ. Atunci când interacțiunea este semnificativă, s-a efectuat testul t Student utilizând pătratul mediu rezidual: *** a indicat că valoarea diferă semnificativ (p ### a indicat că valoarea diferă semnificativ (p Fig 7. HSD a afectat rar expresia genelor ceasului hepatic).

Oscilațiile circadiene ale genelor de ceas CLOCK (A), BMAL1 (B), PER1/2 (C și D), CRY1 (E) REV-ERBα (F), DEC1 (G) și DBP (H) sunt prezentate în raport cu APOE nivelul ARNm. Valorile sunt medii ± SEM, n = 4 la fiecare punct de date. Valoarea medie la ZT2 a fiecărei gene la șobolanii CDA a fost definită ca 100. Rezultatele statistice ale ANOVA bidirecțional sunt indicate în tabelul S5. 0,05 reprezintă modificări semnificative, iar NS înseamnă nesemnificativ.

Se știe că metabolismul lipidic este guvernat în principal de mai mulți factori de transcripție, cum ar fi SREBP (proteina de legare a elementului de reglare a sterolului 1/2), ChREBP (proteina de legare a elementului de răspuns la carbohidrați), LXRα (subfamilia receptorului nuclear 1, grupa H, membrul 3), și PPARα (subfamilia 1 a receptorilor nucleari, grupa C, membrul 1) [25,26], despre care se raportează, de asemenea, că prezintă oscilație circadiană [27-29]. Am speculat că acești factori de transcripție ar fi, de asemenea, afectați de HSD și hrănirea restricționată în timp, deoarece acumularea de lipide hepatice indusă de HSD a fost clar ameliorată de regimul de hrănire restricționat în timp (Fig. 6). Cu toate acestea, expresia acestor gene ale factorului de transcripție a fost greu afectată de HSD sau de hrănire restricționată în timp și toate cele patru grupuri au prezentat modele de expresie similare (Fig. 8). Acest lucru a indicat faptul că atenuarea acumulării de lipide anormale induse de HSD în ficat și sânge prin regimul de hrănire restricționat în timp este probabil independent de factorii circadieni de oscilare-transcripție care mediază metabolismul lipidelor.

Oscilațiile circadiene ale genelor factorului de transcripție SREBP1/2 (A și B), ChREBP (C), LXRα (D) și PPARα (E) sunt prezentate în raport cu nivelul de ARNm APOE. Valorile sunt medii ± SEM, n = 4 la fiecare punct de date. Valoarea medie la ZT2 a fiecărei gene la șobolanii CDA a fost definită ca 100. Rezultatele statistice ale ANOVA bidirecțional sunt indicate în tabelul S6. 0,05 reprezintă modificări semnificative, iar NS înseamnă nesemnificativ.

Discuţie

Sindromul metabolic este în prezent destul de răspândit datorită schimbării generale a dietei din alimentele naturale în alimentele procesate care conțin conținut ridicat de grăsimi, zahăr și sare [2]. Sucroza excesivă a fost recent implicată pentru a juca un rol important în sindromul metabolic [4,5,30]. S-a raportat că excesul de zaharoză induce obezitatea independentă de consumul excesiv de energie și ficatul gras la șobolani, accelerând caracteristicile sindromului metabolic [30]. Rezistența la insulină indusă de obezitate care provoacă boli hepatice grase nealcoolice (NAFLD) este o caracteristică patogenă comună a sindromului metabolic [31]. NAFLD joacă un rol critic în dezvoltarea sindromului metabolic. În studiul nostru de patru săptămâni, HSD a crescut dramatic acumularea de lipide atât în ​​sânge, cât și în ficat, indicând patogeneza ficatului gras. Hrănirea limitată în timp a HSD, doar în faza activă, a suprimat practic depunerea crescută de lipide, prezentând ameliorarea dezvoltării ficatului gras.

De remarcat, a existat o întârziere a creșterii temperaturii corpului la debutul perioadei întunecate (faza activă) la șobolanii de hrănire cu timp limitat (Fig. 3 și tabelul S2). Temperatura corpului oscilează de obicei între 37-39 ° C la mamiferele aflate sub controlul hipotalamusului; variațiile diurne ale temperaturilor corpului sunt asociate cu oscilațiile metabolismului energetic [46]. Am speculat că vor exista mai multe cheltuieli energetice la șobolanii HSDR, deoarece regimul de hrănire restricționat în timp a atenuat acumularea de lipide indusă de HSD. Cu toate acestea, șobolanii HSDR au prezentat o amplitudine similară a temperaturii corpului ca șobolanii HSDA. Deși nu a existat un efect de interacțiune semnificativ al dietei și al sincronizării fazelor (Tabelul S2), șobolanii HSDR au avut tendința de a întârzia creșterea temperaturii corpului la începutul perioadei întunecate (Fig. 3C). Deși această întârziere nu a explicat suprimarea acumulării de lipide în sânge și ficat, rămâne de descoperit rolul potențial al acestei întârzieri în metabolismul lipidic.

Consumul în exces de zaharoză a fost recunoscut ca principalul factor cauzal în sindromul metabolic [4,5,30]. Regimul alimentar cu durată limitată de HSD, în faza activă, este un mod eficient, precum și practic, de a atenua efectele adverse induse de HSD, în special impactul său asupra ficatului gras. Intervenția de hrănire limitată în timp a avut succes la mai multe animale, inclusiv șobolani obezi Zucker [15], șoareci [13,14,48] și oameni [49], cu diferite tipuri de diete. Comparativ cu majoritatea intervențiilor dietetice și nutriționale, în tratamentul bolilor metabolice induse de dietă, care se concentrează pe reducerea cantității și restricționarea aportului de energie, regimurile de hrănire restricționate în timp au devenit o strategie de intervenție preferabilă. Studiul nostru privind hrănirea HSD cu restricție de timp la șobolanii Wistar în decurs de 12 ore de fază activă stabilește, de asemenea, o nouă dovadă a realizării acestui regim de hrănire cu restricție de timp.