Școala de afiliere de medicină chineză post-bacalaureat, Colegiul de medicină chineză, China Medical University, Taichung, Taiwan

cardiacă

Roluri Analiză formală, Scriere - proiect original

Afiliat Institutul de absolvenți de științe medicale de bază, China Medical University, Taichung, Taiwan

Afiliere Traducere Cercetare Core, China Medical University Hospital, China Medical University, Taichung, Taiwan

Roluri Curarea datelor

Divizia de afiliere pentru cardiologie, Spitalul Universitar Medical din China, Taichung, Taiwan

Școala de afiliere de medicină chineză, China Medical University, Taichung, Taiwan

Departamentul de afiliere pentru medicină internă, Divizia de Cardiologie, Spitalul General Taichung al Forțelor Armate, Taichung, Taiwan

Departamentul de Chirurgie pentru Afiliere, Școala de Medicină, Colegiul de Medicină, Universitatea de Medicină Taipei, Taipei, Taiwan

Departamentul de afiliere a biotehnologiei, Universitatea Bharathiar, Coimbatore, India

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Wei-Wen Kuo, Chih-Yang Huang

Departamentul de afiliere pentru știință și tehnologie biologică, China Medical University, Taichung, Taiwan

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Wei-Wen Kuo, Chih-Yang Huang

Roluri Conceptualizare, achiziție de finanțare, administrare de proiecte, resurse

Afiliații Colegiul de Medicină, Spitalul Hualien Tzu Chi, Fundația Medicală Budistă Tzu Chi, Universitatea Tzu Chi, Hualien, Taiwan, Departamentul de Cercetări Medicale, Spitalul Universitar Medical din China, Universitatea Medicală din China, Taichung, Taiwan, Departamentul de Biotehnologie, Universitatea Asia, Taichung, Taiwan

  • Ruey-Lin Chang,
  • Srinivasan Nithiyanantham,
  • Chih-Yang Huang,
  • Pei-Ying Pai,
  • Tung-Ti Chang,
  • Lai-Chin Hu,
  • Ray-Jade Chen,
  • V. VijayaPadma,
  • Wei-Wen Kuo,
  • Chih-Yang Huang

Cifre

Abstract

Citare: Chang R-L, Nithiyanantham S, Huang C-Y, Pai P-Y, Chang T-T, Hu L-C și colab. (2019) Hipertrofie patologică cardiacă sinergică indusă de o dietă bogată în sare la șobolanii transgenici cardiaci specifici IGF-IIRα. PLoS ONE 14 (6): e0216285. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0216285

Editor: Luis Eduardo M. Quintas, Universitatea Federală din Rio de Janeiro, BRAZILIA

Primit: 18 septembrie 2018; Admis: 17 aprilie 2019; Publicat: 18 iunie 2019

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se găsesc în lucrare.

Finanțarea: Acest studiu a fost susținut de China Medical University - 105-S-07, Taiwan; China Medical University and Hospital - 02, Taiwan; Universitatea Asia - 106, Taiwan. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Recent, am identificat noi alternative de splicing IGF-IIR trunchiat utilizând amplificarea rapidă a capetelor ADNc (RACE) și analiza secvenței. Acestui fragment îi lipsea segmentul exon 1-9 IGF-IIR, dar consta din intron 9 (nt 645-806) - exon10- intron 36 (nt 1-455). Modelul de expresie a ARNm, de exemplu, specific intronului 9 (nt 645-806) a dezvăluit expresia sa în inimă, creier, ficat, placentă și testicul șobolanilor. Mai mult, am confirmat, de asemenea, că acest transcript poate codifica o proteină cu 1359 aminoacizi cu codon de pornire la 231 bp (exon 10) și opri codonul la 4307 bp (intron 36). Prin analiza secvenței, am constatat că aminoacizii proteinei trunchiate erau în concordanță cu IGF-IIR, cu excepția aminoacidului C-terminal 15. Am denumit noua proteină IGF-IIRα și ne-am propus să identificăm semnificația sa biologică și implicarea sa în fiziopatologia cardiacă.

IGF-IIRα reglează apoptoza cardiacă prin reglarea descendentă a proteinelor de supraviețuire AKT/PI3K de semnalizare și reglarea în sus a activării caspazei 3. În plus, supraexprimarea IGF-IIRα reglează fibroza cardiacă prin semnalizarea uPA/tPA/TGF-β și acumularea mai mare de colagen și a agravat în continuare efectul acesteia în condiții de sare ridicată [11]. În acest studiu, ne-am propus să identificăm dacă IGF-IIRα nou este implicat în hipertrofia cardiacă și continuă rolul său funcțional în insuficiența cardiacă hipertensivă indusă de sare în vivo. Apoi, am dori să investigăm dacă IGF-IIRα ar putea fi o țintă terapeutică potențială nouă pentru insuficiența cardiacă.

Materiale și metode

Anticorpi și reactivi

Toate substanțele chimice și reactivii au fost achiziționați de la Sigma-Aldrich, SUA. Pentru western blot, anticorpii primari p-ERK, p-JNK, p-P38 au fost cumpărați de la Cell Signaling, SUA. IGF-IIR, AT1R, NFATC3, ANP, BNP, α-tubulină, p-PKC (Abcam, SUA) și GAPDH, SIRT1, Gαq, p-GATA4 (Santa Cruz Biotechnology, SUA). Toți anticorpii secundari (anti-iepure, șoareci și capre, anticorpi conjugați cu HRP) au fost procurați de la Santa Cruz Biotechnology, SUA.

Construcție transgenică

Construcția transgenică include promotorul rMYH6, ADN-ul BAC 3HA-IGF-IIRα-A2 (NCBI). 3HA-IGF-IIRα-A2 a fost amplificat și ligat în vectorul de expresie al promotorului rMYH6. Exemplele de secvențe utilizate includ IGF-IIRα: 5’IGF-IIRα-KnpI: 5’-TTGGTACCGAATGAGTGTCATAAACTTTGAG-3 ’și 3’-IGF-IIRα-XbaI: 5’-CCCTCTAGAAGTCATGTCGGCTGCTGTGAGTGA. Apoi am subclonat cu succes lungimea completă a IGF-IIRα în pcDNA3.1-myc-His condus de promotorul cardiac specific α-MHC prin microinjecție pronucleară și am dezvoltat IGF-IIRα peste șobolani transgenici de expresie (TG). Fondatorii pozitivi au fost identificați prin PCR și încrucișați la WT. Genotiparea a fost efectuată prin analize PCR cu primeri specifici. Grund înainte 5’-TAGCAAACTTCAGCCACCCTTC-3 ’și grund invers 5’-ACTTCCACTCTTATCCACAGCACAC-3’ care au fost proiectate pentru a amplifica un fragment de 739bp.

Procedura animalelor

Toate protocoalele au fost revizuite și aprobate de IRB (Institutional Review Board) și de grupul consultativ pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din China Medical University, Taichung, Taiwan. Animalele au fost procurate de la BioLasco Co., Ltd., Taipei, Taiwan. Fondatorul masculin TG avea o deficiență a fertilității. În studiul nostru, am folosit animale Sprague-Dawley (SD) feminine în vârstă de opt săptămâni, li s-a furnizat o dietă standard (dieta de rozătoare de laborator 5001) și apă de la robinet și a fost menținută la o temperatură constantă (22 ° C) pe o lumină/întuneric de 12 ore ciclu. După o perioadă de aclimatizare de 4 săptămâni, animalele au fost împărțite în 4 grupuri cu câte 6 animale în fiecare grup: șobolani SD (WT), șobolani SD-TG (IGF-IIRα) (TG), șobolani SD + cu conținut ridicat de sare (8% ridicat) sare) (WT-HD), SD-TG (IGF-IIRα) + șobolani cu dietă bogată în sare (8% sare ridicată) (TG-HD). Perioada de tratament este de aproximativ 16 săptămâni. Dietele bogate în sare sunt obținute din dietele de cercetare, NJ, SUA. După tratament, toți șobolanii au fost sacrificați prin decapitare sub anestezie terminală și inimile au fost colectate. În cele din urmă, țesutul cardiac a fost colectat și depozitat la -80 ° C pentru analiză ulterioară.

Ecocardiografie

Ecocardiografia a fost efectuată pentru șobolani SD, șobolani SD-TG (IGF-IIRα), șobolani SD + cu conținut ridicat de sare (8% sare ridicată), SD-TG (IGF-IIRα) + șobolani cu dietă bogată în sare (8% sare ridicată) înainte sacrificând. Șobolanii au fost anesteziați cu izofluran și ecocardiografia a fost efectuată folosind traductoare liniare de 12 MHz și traductor sectorial de 5-8 MHz (Vivid 3, Ecografie General Electric Medical Systems, Tirat Carmel, Israel). Măsurătorile au fost realizate din planuri M-mode și imagini bidimensionale obținute pe axele lungi și scurte parasternale la nivelul mușchilor papilari după observarea a cel puțin șase cicluri cardiace. IVSd - Grosimea septului intervenventricular la diastola finală, LVIDd - Dimensiunea internă ventriculară stângă la diastola finală, LVPWd - Grosimea peretelui posterior ventricular stâng la diastola finală, IVSs - Grosimea septului interventricular la sistola finală, LVIDs - Dimensiunea internă ventriculară stângă la sistolă finală, LVPWs - Grosimea peretelui posterior al ventriculului stâng la sistola finală, SV - Volumul accident vascular cerebral, Masa LVd - Masa diastolei ventriculare stângi, Masa LVs - Masa sistolei ventriculare stângi au fost măsurate.

Extracția proteinei țesuturilor

Țesutul ventriculului stâng a fost colectat și omogenizat folosind tampon de liză (20mM Tris, 2mM EDTA, 50mM β-mercaptoetanol, 10% glicerol, inhibitor de protează, inhibitor de fosfatază, pH 7,4). Omogenatele au fost menținute la -20 ° C peste noapte și centrifugate la 12.000 rpm timp de 30 de minute. După centrifugare, supernatantul a fost colectat și depozitat la -80 ° C pentru analiză ulterioară.

Western blot

Western blot pentru analiza expresiei proteinelor a fost descris anterior cu ușoare modificări [12]. Concentrația de proteine ​​a țesutului cardiac a fost estimată prin analiza proteinelor Lowry. Probele de proteine ​​40 μg/bandă au fost rezolvate cu un gradient de 8-15% SDS-PAGE cu o tensiune constantă. Apoi gelul a fost transferat la o membrană PVDF (GE Healthcare Life Sciences) timp de 90 de minute la 90V. După transfer, membrana a fost plasată într-o soluție de blocare (3% BSA) timp de o oră la temperatura camerei. După spălare cu TBST, membrana a fost incubată cu respectivul anticorp primar peste noapte la 4 ° C. Apoi, membrana a fost incubată cu anticorp secundar timp de o oră la temperatura camerei. Apoi, petele au fost vizualizate folosind un reactiv Western blot de chemiluminiscență ECL (Millipore) în Fujifilm LAS-3000 (GE Healthcare). Intensitățile au fost cuantificate folosind ImageJ.

Colorarea hematoxilinei și eozinei

Inima a fost fixată în 4% formaldehidă tamponată și secțiuni groase de 2 μm au fost tăiate din blocuri de țesut încorporate în parafină. Pentru colorarea histopatologică, feliile au fost contracolorate cu hematoxilină-eozină, urmând instrucțiunile producătorului. Diametrul mediu al cardiomiocitului a fost analizat cu ajutorul unui software de analiză a imaginii. Toate măsurătorile au fost calculate în medie din trei felii.

analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată cu software-ul GraphPad Prism, versiunea 6.01, California. Toate datele sunt exprimate ca medie ± SD. Datele au fost supuse unei analize bidirecționale a varianței, urmată de testele post hoc ale lui Tukey. Nivelul de semnificație statistică și nivelul de încredere au fost stabilite ca p Fig 1. Identificarea formei alternative de îmbinare a IGF-IIR: IGF-IIRα și dezvoltarea șobolanilor transgenici IGF-IIRα.

(a) identificarea transcrierilor noi ARNm IGF-IIRα conținute intron9 (nt 645-806). Detectarea transcrierilor de ARNm prin pete nordice folosind sonda de etichetare a ADN-ului amorsat aleatoriu conținea intron9 (nt 645-806) în diferite probe de țesut, (b) domeniul structural al IGF-IIR și IGF-IIRα, (c) lungimea completă a IGF-IIR și ARNm IGF-IIRα, (d) diagramă schematică a construcției vectorului transgenic IGF-IIRα. IGF-IIRα cu N-terminal 3XHA, care este condus de promotorul specific cardiac promotor Myh6, (e) genotiparea ADN-ului a fost efectuată prin PCR pentru identificarea fondatorilor TG-IGF-IIRα pozitivi și (f) exprimarea proteinelor TG-IGF-IIRα din inima.

IGF-IIRα a indus leziuni cardiace în dieta normală și bogată în sare

Am identificat că șobolanii TG-HD și WT-HD au arătat o creștere a dimensiunii inimii lor comparativ cu șobolanii WT. TG-HD a arătat mărirea inimii în comparație cu șobolanii omologi TG (Fig. 2A). Zona cardiomiocitelor histologice a fost semnificativ mai mare în TG-HD, WT-HD, TG comparativ cu WT (Fig. 2B și 2C). Datele morfologice sunt rezumate în Tabelul 1. Nu au existat diferențe semnificative în greutatea corporală și tibia între grupuri. A existat o diferență semnificativă în WHW, WHW/tibia, WHW/BW între grupuri. În studiul de față, am observat că greutatea totală a inimii crește la șobolanii WT-HD și TG-HD în comparație cu șobolanii WT. Aceste rezultate sugerează că IGF-IIRα reglează hipertrofia cardiacă.

(a) inima șobolanilor TG-IGF-IIRα s-a mărit dramatic și (b, c) imagini histologice reprezentative cu colorare hematoxilină și eozină a secțiunilor cardiace. Analiza histopatologică relevă faptul că hipertrofia indusă de sare ridicată și leziunile cardiace severe la șobolanii TG-IGF-IIRα. ***: p.

IGF-IIRα este responsabil pentru hipertrofia cardiacă

Studiile noastre anterioare demonstrează că IGF-IIR reglează mecanismul de hipertrofie cardiacă [10]. Deci, în acest studiu, ne-am propus să înțelegem dacă IGF-IIRα, forma alternativă de îmbinare a IGF-IIR ar putea implica în reglarea hipertrofiei. Mai mult, rolul său la șobolanii cu conținut ridicat de sare își va arăta importanța funcțională în condițiile de stres. În studiul nostru actual, am constatat că șobolanii WT-HD și TG-HD au prezentat expresii crescute ale markerilor de hipertrofie ANP și BNP comparativ cu șobolanii WT (Fig. 3). Mai mult, expresiile ANP și BNP au fost semnificativ mai mari în TG-HD comparativ cu șobolanii WT. Aceste descoperiri au arătat că IGF-IIRα reglează hipertrofia cardiacă și provoacă în continuare activarea extinsă a markerilor de hipertrofie în condiții cu conținut ridicat de sare.

(a) niveluri de proteine ​​ale markerilor de hipertrofie BNP și ANP, (b) niveluri de expresie cuantificate ale expresiei markerului BNP în WT, TG, WT-HD și TG-HD și (c) expresie de marker de hipertrofie cardiacă ANP în WT, TG, WT- HD și TG-HD. Sunt prezentate Western blots reprezentative *: p Fig 4. Supraexpresia IGF-IIRα reglează în sus calea kinazei MAP în grupurile cu dietă bogată în sare.

(a) expresia proteică a nivelurilor de proteine ​​MAPK legate de hipertrofie în bare WT, TG, WT-HD și TG-HD și (b-d) reprezintă cuantificarea relativă a proteinelor și indică media ± SD. Sunt prezentate Western blots reprezentative *: p Fig 5. IGF-IIRα reglează semnalizarea IGF-IIR prin degradarea SIRT1 și acetilarea HSF1.

(a) nivelurile de expresie ale IGF-IIR, IGF-IIRα, AT1R, SIRT1, HSF1 și Gαq. Exprimarea proteinelor din țesutul cardiac (b) IGF-IIR, (c) IGF-IIRα, (d) AT1R, (e) SIRT1, (f) HSF1 și (g) Gαq. Sunt prezentate Western blots reprezentative *: p Fig 6. TG-IGF-IIRα provoacă hipertrofie patologică în grupurile cu dietă bogată în sare.