Abstract

Factorul de creștere a hepatocitelor (HGF) are diferite efecte în special asupra celulelor epiteliale. Cu toate acestea, rolul precis al HGF asupra lipogenezei nu este încă pe deplin înțeles. O dietă bogată în grăsimi a fost administrată șoarecilor transgenici HGF și șoarecilor martor de tip sălbatic in vivo. Mai mult, HGF uman recombinant (rhHGF) a fost administrat liniei celulare HepG2 in vitro. Am efectuat o analiză cu privire la factorii care se referă la metabolismul lipidelor. O supraexpresie a HGF ameliorează dramatic un ficat gras indus de o dietă bogată în grăsimi. Șoarecii transgenici HGF au prezentat o acumulare lipidică aparent redusă în ficat. Activarea proteinei de transfer trigliceridic microsomal (MTP) și a apolipoproteinei B (ApoB) care însoțesc niveluri mai ridicate de trigliceride în ser au fost găsite la șoarecii transgenici HGF pe o dietă normală. Interesant este că această reglare ascendentă a activării MTP a devenit mai evidentă în dieta bogată în grăsimi. În plus, administrarea rhHGF a stimulat expresia MTP și ApoB, reducând în același timp conținutul redus de lipide intracelulare în linia celulară HepG2. Cu toate acestea, această inducere a MTP și ApoB de către HGF a fost clar inhibată de PD98059 (inhibitor MAPK). În concluzie, datele prezentate în acest studiu au indicat faptul că HGF ameliorează un ficat gras indus de o dietă bogată în grăsimi prin activarea MTP și ApoB.

indus

ficatul gras este o boală frecventă la pacienții însoțiți de obezitate și diabet, iar una dintre principalele cauze ale dezvoltării obezității și diabetului la om este o dietă bogată în grăsimi.

Boala ficatului gras nealcoolic (NAFLD) a crescut ca o afecțiune care în cele din urmă progresează spre boala hepatică în stadiu final. Tabloul patologic seamănă cu cel al leziunilor hepatice induse de alcool, dar apare la pacienții care nu abuzează de alcool. NAFLD afectează 10–24% din populația generală din diferite țări. Prevalența crește la 57,5-74% la populațiile obeze (1).

Deși au fost susținute diferite modalități de tratare a acestei boli (7, 21), nu s-a dovedit că medicamentele definitive îmbunătățesc direct NAFLD.

NAFLD este o leziune hepatică în care anomaliile histopatologice imită pe cele ale steatohepatitei alcoolice (19). Administrarea factorului de creștere a hepatocitelor (HGF) s-a dovedit recent că îmbunătățește ficatul gras alcoolic (28, 29), dar efectul precis al HGF asupra NAFLD rămâne de elucidat. Prin urmare, am investigat dacă administrarea HGF ar putea fi sau nu eficientă pentru îmbunătățirea NAFLD.

HGF este o polipeptidă caracterizată inițial ca un mitogen hepatocitar puternic (10, 20). Studii recente au arătat că HGF este o citokină multifuncțională care poate provoca răspunsuri mitogene, motogene și morfogene într-o varietate de celule epiteliale cultivate care exprimă receptorul transmembrana tirozin kinazei, c-Met (5, 38).

Am dezvoltat și menținut linia transgenică HGF și am dezvăluit mai multe fenotipuri (25, 30, 32). Folosind acest model de șoarece, am examinat efectul HGF în NAFLD cu dieta bogată în grăsimi. Mai mult, studiile ulterioare au condus la înțelegerea faptului că îmbunătățirea leziunii alcoolice a ficatului a fost urmată de reglarea în sus a proteinelor de transfer trigliceridic microsomal (MTP) și a apolipoproteinei B (ApoB) (28, 29). Prin urmare, am efectuat o examinare suplimentară după cum urmează, folosind MTP și ApoB în modelul NAFLD.

MTP este un factor care limitează rata producției de lipoproteine ​​cu densitate foarte mică care conțin ApoB (12, 18, 37). MTP este o proteină intracelulară exclusivă (12) și rolul său principal este de a transfera lipidele pe polipeptidele ApoB din reticulul endoplasmatic al celulelor secretoare de lipoproteine ​​(12).

Am demonstrat aici că o supraexpresie a HGF ameliorează dramatic un ficat gras indus de dietă bogată în grăsimi in vivo. Mai mult, am arătat că acest efect protector al HGF se datorează activării MTP și ApoB.

Șoareci transgenici și tratament.

Șoarecii transgenici (Tg), în care expresia unui ADNc HGF murin a fost condus de promotorul metalotioneinei și regiunile de control al locusului, au fost generați pe fundalul genetic albin consangvin FVB/NCr (denumit în continuare FVB) așa cum este descris anterior (30) . Mai mult, Takayama și colab. au demonstrat că transgenele HGF s-au exprimat în toate organele și au existat mai multe fenotipuri, cum ar fi hepatomegalia, boala chistică însoțită de glomeruloscleroză focală segmentară, ulcerația asociată cu inflamația cronică activă a rectului și așa mai departe (25, 31-33).

Au fost folosiți șoareci masculi Tg și FVB de șase până la 8 săptămâni de tip sălbatic (WT). Toate studiile pe animale au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare pentru îngrijirea și utilizarea animalelor stabilite de Consiliul de revizuire instituțională al Școlii de Medicină a Universității Gunma. WT și Tg au fost plasate după înțărcare (vârsta de 3 săptămâni) fie pe o dietă bogată în grăsimi (60% din caloriile derivate din grăsimi; D12492, Research Diets, New Brunswick, NJ), fie pe o dietă normală de chow (10% din caloriile derivate) din grăsime) din grăsime; D12450B, Research Diets). Șoarecii au fost hrăniți în perechi cu aceste diete timp de 4 săptămâni.

Analize biochimice și histologice.

Lipidele au fost extrase din 50 mg de omogenat hepatic, iar concentrația lipidică pe greutatea hepatică umedă a fost măsurată conform metodei descrise anterior (9). Pentru analiza histologică, țesutul hepatic a fost fixat în paraformaldehidă 4% și încorporat în parafină. Alternativ, lipidele hepatice au fost colorate printr-o metodă O cu ulei roșu. Pentru analiza proteinelor sau a ARN-ului, specimenele de țesut au fost congelate în azot lichid și depozitate la -80 ° C până la utilizare. Concentrațiile serice de alanină aminotransferază (ALT), trigliceride și glucoză serică au fost măsurate cu un autoanalizator clinic standard (Hitachi 7170; Hitachi, Tokyo, Japonia). Nivelul insulinei serice a fost determinat folosind un kit de radioimunologie pentru insulină (Shionogi, Osaka, Japonia) conform instrucțiunilor producătorului. Nivelurile serice de glucoză și insulină au fost măsurate folosind probele extrase după 12 ore de post.

ApoB în ser sau mediu a fost determinat folosind kitul ApoB ELISA (ALerCHEK, Portland, ME) conform instrucțiunilor producătorului.

Analiza ARN.

Celula de hepatocarcinom uman, HepG2, a fost obținută din colecția American Type Culture Collection (Manassas, VA). Celulele HepG2 (2 × 105) au fost însămânțate într-un vas de 35 mm timp de 24 de ore, mediul a fost schimbat cu DMEM fără ser (GIBCO BRL, Grand Island, NY), iar celulele au fost apoi incubate peste noapte. Mai mult, aceste celule au fost incubate timp de 6 ore cu 40 ng/ml de HGF uman recombinant (rhHGF; R&D Systems, Minneapolis, MN), cu sau fără 20 μM de inhibitor MAPK, PD98059 (Sigma-Aldrich Japan KK, Tokyo, Japonia) sau un inhibitor al fosfatidilinozitol 3 kinazei (PI3K), wortmannin (Sigma-Aldrich Japan KK), timp de 1 oră înainte de stimularea HGF. Colecția de ARN, RT-PCR și metodele de PCR în timp real folosind șoareci de țesut hepatic sau celule au fost descrise anterior (17). Detaliile secvenței sunt prezentate în Tabelul 1.

tabelul 1. Secvențe de perechi de grund utilizate pentru amplificarea ARNm prin PCR în timp real

SREBP, proteina de legare a elementului de reglare a sterolului; G6PD, glucoză-6-fosfat dehidrogenază.

Experimente microarray.

Activitate hepatică MTP.

Activitatea hepatică MTP a fost determinată prin utilizarea unui kit comercial bazat pe transferul mediat de MTP a unei lipide fluorescente neutre auto-stinse de la miezul unei particule donatoare la o particulă acceptor (Roar Biomedical, New York, NY).

Analiza proteinei ApoB.

Pentru imunoprecipitare, 1.000 μg de lizat hepatic au fost incubate cu anticorp anti-ApoB (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) timp de 2 ore pe gheață. După adăugarea Gamma-Bind G Sepharose (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germania) și spălarea în tampon RIPA, imunoprecipitații au fost fracționați pe geluri de poliacrilamidă 10% (BIOCRAFT, Tokyo, Japonia). O analiză Western blot a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (17).

Determinarea conținutului de lipide intracelulare.

Celulele HepG2 au fost incubate în mediu complet cu 10% ser fetal bovin în vase cu diametrul de 100 mm, crescute până la confluență de 70% și menținute în DMEM fără ser peste noapte. Celulele au fost tratate în mediu fără ser timp de 24 de ore, urmată de incubare cu sau fără 50 ng/ml rhHGF în mediu timp de 24 de ore. Conținutul de trigliceride a fost determinat în lizatele celulare printr-o analiză colorimetrică și a fost exprimat ca miligrame de lipide per miligrame de proteină celulară, așa cum s-a descris anterior (36). Lizatele celulare au fost omogenizate și transferate la supernatant și apoi amestecate cu cloroform-metanol și vortexate. După centrifugare, stratul inferior a fost transferat și evaporat. Am măsurat conținutul de trigliceride după adăugarea de 2-propanol (Wako Chemical, Osaka, Japonia).

analize statistice.

Toate datele au fost exprimate ca medii ± SD. Analiza statistică a fost realizată de Student nepereche t-test sau prin ANOVA unidirecțională. Când s-au aplicat analizele ANOVA, diferențele în valorile medii dintre grupuri au fost examinate prin testul de comparație multiplu al lui Fisher.

Greutatea corporală, metabolismul glucozei și nivelul seric al ALT.

Deși greutatea corporală atât a WT cât și a Tg nu a fost diferită, greutatea relativă a ficatului pe greutatea corporală a Tg a fost semnificativ mai mare decât cea a WT în dieta normală (Tabelul 2). Aportul de hrană nu a fost diferit atât între grupuri de dieta, cât și de șoareci. Deoarece se spune că anomalii ale acțiunii insulinei pot fi implicate în patogeneza NAFLD, am măsurat concentrația serică de glucoză și insulină. Ca rezultat, aceste date între ambele grupuri de șoareci nu au fost semnificativ diferite (Tabelul 2). Mai mult, dieta bogată în grăsimi nu a afectat nivelurile serice de ALT la ambii șoareci (Fig. 1A).

FIG. 1.A: nivel alanin aminotransferazei serice (ALT). B și C: concentrațiile serice și, respectiv, de trigliceride hepatice. Fiecare valoare reprezintă media ± SD (n = 6 per grup), *P metode și colorate cu hematoxilină și eozină (A-d) și roșu ulei O (e și f). A, c, și e: WT. b, d, și f: Tg. Mărire originală × 400.

masa 2. Greutatea corpului și ficatului și metabolismul glucozei

WTTGP ValoareGreutatea corporală, g26,7 ± 1,727,4 ± 2,2nsGreutate hepatică relativă,%4,65 ± 0,126,40 ± 1,3

Tabelul 3. Exprimarea proteinelor legate de metabolismul lipidic la șoarecii transgenici HGF

NC, fără schimbare; Eu, măresc.

Expresia și activitatea genei MTP hepatice.

Expresia MTP (Fig. 2A) și activitatea MTP (Fig. 2B) în Tg au fost mai mari decât cele din WT pe dieta normală și bogată în grăsimi. Mai mult, dieta bogată în grăsimi a crescut semnificativ expresia MTP și activitatea MTP la ambii șoareci.

FIG. 2.A: expresie mARN a proteinei de transfer trigliceridic microsomal (MTP) în ficat pe dieta normală cu grăsimi sau dietă bogată în grăsimi. *P

Expresia genei hepatice ApoB și conținutul de proteine ​​ApoB.

În Tg, expresia ApoB a fost semnificativ mai mare decât cea din WT (Fig. 2C). Cu toate acestea, o dietă bogată în grăsimi nu a accelerat expresia ApoB. În mod similar, Western blot a arătat că nivelul proteinei ApoB în ficat a crescut în Tg și dieta bogată în grăsimi nu a crescut nivelul proteinei ApoB în niciunul dintre grupuri.

O analiză Western blot a arătat că proteina ApoB a crescut în ficatul Tg (Fig. 2D). Concentrația serică de ApoB a Tg a fost semnificativ mai mare decât cea a WT în dieta normală și bogată în grăsimi (Fig. 2E).

Expresia și activitatea MTP și expresia și secreția ApoB induse de rhHGF în linia celulară HepG2.

Expresia MTP (Fig. 3A) și activitate (Fig. 3.)B) și expresia ApoB (Fig. 3C) și secreție (Fig. 3D) ambele crescute semnificativ prin stimularea rhHGF. Toate aceste efecte au fost inhibate semnificativ de administrarea concomitentă de rhHGF și PD98059, în timp ce doar administrarea PD98059 nu a avut niciun efect asupra acestor parametri (Fig. 3, A-D). Pe de altă parte, tratamentul cu wortmannin nu a blocat niciun efect HGF (datele nu sunt prezentate).

FIG. 3.Efectul factorului recombinant de creștere a hepatocitelor umane (HGF) și PD98059 (PD) asupra MTP și ApoB în celulele HepG2. A: analiza PCR în timp real a mARN-ului MTP. B: Activitate MTP. C: ApoB. D: Conținut ApoB în mediile de cultură. E: conținut de lipide intracelulare. Banda 1, DMEM fără ser singur (Ctrl.); banda 2, HGF 40 ng/ml; banda 3, HGF 40 ng/ml și PD98059 20 μM; banda 4, PD98059 20 μM singur. Barele de eroare reprezintă abaterea standard a experimentelor triplicate. Rezultate similare au fost obținute în 3 experimente independente. *P

Conținutul de trigliceride intracelulare.

Adăugarea de rhHGF în mediu a indus o reducere a conținutului de lipide intracelulare (Fig. 3E). Mai mult, pretratarea PD95059, un inhibitor MAPK, a blocat acest efect rhHGF. Aceste rezultate au indicat faptul că HGF accelerează secreția de lipide în afara celulei și acest efect părea să acționeze prin calea MAPK, cel puțin parțial.

În prezentul studiu, am demonstrat în mod clar că o supraexpresie a HGF ameliorează dramatic un ficat gras indus de dietă bogată în grăsimi in vivo, precum și mecanismul de accelerare a secreției de lipide din ficat de către HGF.

În studiile in vitro, s-a raportat că HGF reglează metabolismul lipidic, cum ar fi stimularea sintezei lipidelor și a secreției de lipoproteine ​​(15, 16, 24, 26, 27). Pe de altă parte, în studiile in vivo, s-a raportat că reactivii antidiabetici pioglitazonă și metformină îmbunătățesc ficatul gras alcoolic prin inducerea expresiei ApoB și a activității MTP prin c-întâlnit activare (3, 34). Mai mult, Borowiak și colab. (4) au raportat că pierderea pe termen lung a Metului duce la steatoză microvesiculară în ficatul șoarecilor condiționați cu mutație Met. De asemenea, am demonstrat că la șoarecii transgenici NK2 s-a observat o acumulare masivă intracelulară de lipide în hepatocite la 48 de ore după o hepatectomie parțială (22). Deoarece NK2 a fost considerat un antagonist al HGF al unei varietăți de activități biologice (23), aceste două modele de șoarece sugerează că semnalizarea HGF-c-Met joacă un rol crucial în acumularea de lipide în ficat.

Conținutul de trigliceride hepatice este modulat de mai mulți factori care afectează sinteza și oxidarea acizilor grași hepatici și secreția de trigliceride din ficat (11). Profilurile de expresie genică care reglementează oxidarea, sinteza trigliceridelor sau secreția sunt prezentate în Tabelul 3. Nu au existat diferențe în aceste gene, cu excepția MTP și ApoB între WT și Tg. Mai mult, am confirmat, de asemenea, nivelurile de expresie ale genelor reprezentative prin PCR în timp real (Tabelul 1). Ca rezultat, printre numeroasele gene care reglementează oxidarea, sinteza sau secreția trigliceridelor, expresia genică a ApoB și MTP a fost diferită între WT și Tg. Mai mult, am examinat aceste gene mai îndeaproape la nivel de ARN, proteine ​​și activitate așa cum sa raportat anterior (28, 29).

S-a demonstrat deja că un efect inhibitor asupra secreției hepatice de lipoproteine ​​cu densitate foarte mică a fost una dintre cauzele majore ale ficatului gras alcoolic (6, 13, 35). Un studiu anterior a arătat că ficatul gras alcoolic este însoțit de reducerea MTP, iar HGF a îmbunătățit ficatul gras prin normalizarea expresiei MTP (28, 29). În sistemul nostru, expresia MTP a fost crescută mai mult pe dieta bogată în grăsimi decât pe dieta normală (Fig. 2A). Prin urmare, HGF a îmbunătățit ficatul gras, indiferent de nivelul de expresie MTP. Mai mult, am arătat nu numai că am analizat nivelurile de proteine ​​legate de secreția de lipide, ci și faptul că conținutul de lipide intracelulare a scăzut datorită HGF. Cu toate acestea, ar fi necesare studii suplimentare pentru a clarifica imaginea de ansamblu asupra HGF și a metabolismului lipidelor.

Pe de altă parte, dieta bogată în grăsimi a crescut mARN-ul MTP, dar nu mARN-ul ApoB. Deoarece ApoB este controlat posttranslațional în procesul lor metabolic (2, 8), o dietă bogată în grăsimi nu ar putea accelera expresia ApoB (Fig. 2C). Cu toate acestea, expresia ApoB în Tg a fost mai mare decât cea din WT. Aceste date au indicat faptul că HGF a afectat direct ApoB la nivel transcripțional în mod diferit din cauza dietei bogate în grăsimi.

Deoarece cascadele Ras/MAPK și PI3K sunt considerate a fi cele două căi majore în semnalizarea HGF/c-Met (39), am investigat semnalizarea folosind inhibitorul MAPK PD98059 și inhibitorul PI3K wortmannin in vitro. Activarea MTP și ApoB de către HGF a fost blocată de PD98059 nu, ci de wortmannin (Fig. 3). Acest rezultat a indicat faptul că semnalizarea HGF/c-Met a reglementat expresia MTP și ApoB prin calea MAPK cel puțin parțial.

Pe de altă parte, Tg a raportat că are mai multe fenotipuri, cum ar fi anomalii de dezvoltare (30), disfuncție renală (31) și boli intestinale (33), precum și hepatomegalie cu transformare neoplazică spontană (25, 32). Atunci când se utilizează HGF pentru tratamentul ficatului gras în viitor, este necesar să se acorde o atenție deosebită unor astfel de modificări patologice, inclusiv hepatocarcinogeneza.

În concluzie, sa constatat că HGF ameliorează un ficat gras indus de o dietă bogată în grăsimi, inducând în același timp hiperlipidemie prin accelerarea sistemului de secreție de lipide, inclusiv MTP și ApoB. Prin urmare, HGF poate fi un tratament potențial eficient pentru NAFLD; cu toate acestea, sunt necesare studii suplimentare pentru a elucida dacă hiperlipidemia sau oncogeneza (14) ar putea fi posibile efecte secundare ale administrării HGF.

NOTĂ DE PICIOASĂ

Costurile de publicare a acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxelor de pagină. Prin urmare, articolul trebuie marcat prin prezenta „publicitate”În conformitate cu 18 U.S.C. Secțiunea 1734 doar pentru a indica acest fapt.

Autorii îi mulțumesc Dr. Glenn Merlino (Institutul Național de Sănătate, Bethesda, MD) pentru furnizarea tulpinii transgenice HGF MH19 și Yuka Nakajima pentru asistență în experimente.