Fiziologia nevertebratelor

Editat de
Senthil-Nathan, Sengottayan

Universitatea Manonmaniam Sundaranar, India

Revizuite de
Sengodan Karthi

Universitatea Manonmaniam Sundaranar, India

Umesh K. Gautam

Centrul de Biologie, Academia de Științe din Republica Cehă (ASCR), Cehia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

extract

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de protecție a plantelor, Facultatea de Științe Agricole, Universitatea din Guilan, Rasht, Iran
  • 2 Departamentul de Cercetare a Mătăsii, Facultatea de Științe Agricole, Universitatea din Guilan, Rasht, Iran

Efectul Withania somnifera, un extract de semințe de plante medicinale, a fost testat împotriva piralidului de dud mai mic, un potențial dăunător al dudului. Frunzele de dud au fost folosite pentru producția de mătase în zonele rurale din nordul Iranului. Extractul a fost administrat pe cale orală prin metoda de scufundare a frunzelor în două doze mai mici (5% W/V) și mai mari (15% W/V) la larvele de a treia etapă (2+, 0,4 kU/l glicerochinază, 2 kU/l peroxidază, 2 kU/l lipoproteină lipază, 0,5 mM 4-aminoantipirină și 0,5 kU/L glicerol-3-fosfat-oxidază. Zece microlitri ai probei au fost incubați cu 10 μL de apă distilată și 70 μL de reactiv timp de 20 min la 25 ° C Formulele de mai jos au fost utilizate pentru a estima cantitatea de trigliceride:

mg/dL = densitatea optică a probei/densitatea optică standard × 0,01126.

Citirea a fost făcută la 545 nm (Fossati și Prencipe, 1982) într-un cititor ELISA (Awareness, Statele Unite). Pentru măsurarea glicogenului, toate larvele au fost udate în 1 ml de KOH 30%. Eprubetele acoperite cu folie de aluminiu și fierte timp de 30 de minute. Tuburile au fost mai întâi vortexate și apoi plasate pe cuburi de gheață. S-au folosit 2 ml de etanol 95% pentru a separa glicogenul de soluție. Probele au fost din nou vortexate și lăsate pe sacul de gheață timp de 30 de minute. Centrifugarea a fost efectuată la 13.000 g timp de 30 de minute. Peletele de glicogen astfel formate au fost colectate și amestecate în apă distilată (1 ml) și apoi vortexate. Probele de etalon pentru glicogen au fost preparate în ordine crescătoare (0, 25, 50, 75 și 100 mg/ml) și apoi amestecate cu fenol (5%). Probele au fost incubate pe baie de gheață timp de 30 de minute. În cele din urmă, absorbanța a fost citită la 490 nm (Chun și Yin, 1998).

Activitatea α-amilazei a fost estimată pe baza metodei lui Bernfeld (1955). Amidonul (1%) a fost utilizat ca substrat. Enzima (10 μL) a fost incubată cu tampon Tris-HCl (50 μL de 20mM la pH 7,1) și 20 μL de amidon (1%) la 30 ° C timp de 30 de minute. După adăugarea a 100 μL de acid dinitrosalicilic (DNS), acesta a fost încălzit într-un filtru de apă, setat la punctul de fierbere timp de 1 minut și apoi citit la 540 nm.

Metoda lui Garcia-Carreno și Haard (1993) a fost utilizată pentru a determina proteaze generale folosind 1% azocaseină ca substrat pentru activitatea lor. În acest scop, supernatantul (10 μL) și tamponul (15 μL) și 50 μL de substrat au fost incubate timp de 3 ore la 37 ° C într-un cuptor. Pentru a opri reacția s-au adăugat 150 μl de acid tricloracetic 10%. Semifabricatele au fost preparate prin adăugarea acidului tricloracetic la substrat. Lichidele au fost apoi păstrate la frigider (4 ° C) timp de 30 de minute, iar apoi centrifugarea s-a făcut la 13.000 g. Mai târziu, un amestec de supernatant și NaOH, câte 100 μL, au fost transferate pe plăci ELISA și citite la 440 nm.

Activitatea enzimei lipazei a fost măsurată în conformitate cu metoda lui Tsujita și colab. (1989). Folosind 18 μL de substrat p-nitrofenil butirat (50 mM) și apoi amestecându-l cu extract de intestin mediu (10 μL) la care au fost incluși 172 μL de soluție tampon universală (1 M) (pH 7) și apoi incubat la 37 ° C și citit la 405 nm.

Pentru estimarea α-glucozidazei și a β-glucozidazei s-a urmat metoda utilizată de Silva și Terra (1995) în care s-au incubat 15 μL de soluție enzimatică cu 30 μL de p-nitrofenil-α-glucopiranozid (5mM) substrat pentru - glucozid și p-nitrofenil-β-glucopiranozidă (5 mM) ca substrat pentru β-glucozidază, respectiv. Apoi, la fiecare dintre soluții s-au adăugat 50 μL de tampon universal (50 mM fosfat de borat de sodiu pH 7,1) și s-a lăsat să reacționeze timp de 10 minute la 37 ° C. Urmat de observare la 405 nm.

Activitatea generală a esterazelor a urmat metodele lui Van-Asperen (1962). Un intestin întreg a fost omogenizat mai întâi în 1000 μL de tampon fosfat 0,1 mM (pH 7) care a inclus Triton x-100 (0,01%) și soluția a fost centrifugată la 10.000 g timp de 10 minute la 4 ° C. Microtuburile au fost înlocuite cu noi microtuburi tampon fosfat a fost adăugat la fiecare și observarea a fost făcută la 630 nm.

Pentru a determina activitatea glutation s-transferazei (GST), procedura lui Habing și colab. (1974) a fost încorporat folosind 1-clor-2,4-dinitrobenzen (CDNB) (20 mM) ca substrat. Larva omogenizată cu 20 μL de apă distilată a fost centrifugată la 12.500 g timp de 10 minute la 4 ° C. Cincisprezece microlitri de supernatant și 135 μL tampon fosfat (pH 7) cu 50 μL CDNB au fost amestecați cu 100 μL GST. Modificarea absorbanței la 340 nm a fost înregistrată timp de 1 min la intervale de 9 s la 27 ° C.

Analiza activității fenoloxidazei

Pentru măsurarea activității fenoloxidazei, hemolimfa și soluția salină tampon fosfat steril rece cu gheață (PBS) a fost utilizată într-un raport de 10-90 μL, respectiv. L-DOPA (3, 4-dihidroxifenilalanină) (10 mM, Sigma-Aldrich Co., Statele Unite) a fost utilizat ca substrat pentru testarea acestei enzime, urmând procedura Catalán și colab. (2012), cu unele modificări. Centrifugarea probelor a fost efectuată la 5.000 g (4 ° C și 5 min). Apoi s-au amestecat 50 pl de soluție cu 150 pl de aminoacid L-DOPA. Activitatea a fost calculată prin împărțirea absorbanței cu cantitatea de proteine ​​din hemolimfă. Cu toate acestea, conținutul de proteine ​​a fost măsurat urmând metoda lui Lowry și colab. (1951). Activitatea specifică a fenoloxidazei a fost înregistrată la 490 nm în timpul reacției.

Histologia midintelui larvar și ovarului adult

Sistemul digestiv al G. pyloalis larvele de a cincea etapă după ce au fost hrănite cu frunze tratate începând cu a treia etapă au fost disecate sub stereomicroscop (Olympus Japonia) în ser fiziologic izotonic. Sistemul digestiv disecat a fost fixat imediat în lichidul lui Buin timp de 24 de ore. Apoi se spală mai întâi cu apă de la robinet și apoi cu apă distilată. Au fost prelucrate pentru deshidratare în etanol (30, 50, 70, 90% și apoi absolut), iar parafina a fost utilizată pentru încorporare. Secțiunile au fost tăiate la 5 μm grosime printr-un microtom rotativ (Model 2030; Leica, Germania). S-a folosit colorarea de rutină cu hematoxilină și eozină (Merck). Fotografii în control vs. tratamentele au fost luate ori de câte ori este necesar la microscopul cu lumină (microscop cu lumină M1000; Leica) echipat cu o cameră digitală EOS 600D (Canon, Japonia). Ovarul adulților în vârstă de 2 zile a fost disecat într-un mod similar și prelucrat așa cum este descris pentru intestin. Cu toate acestea, secțiunile au fost tăiate longitudinal.

Numărul total și diferențial de hemocite (THC și DHC)

Microscopie cu contrast de fază

Hemolimfa a fost colectată de la fiecare proleg de larvă incizată și a fost amestecată imediat cu anti-coagulant (0,166 M NaCI, 0,098 M NaOH, 0,041 M acid citric și 0,017 M EDTA, pH 4,5). Cinci microlitri din soluție au fost așezați pe o lamă de sticlă făcând o peliculă subțire folosind sticlă acoperitoare. Diferitele hemocite au fost identificate prin microscopie cu contrast de fază, iar fotografiile au fost făcute folosind microscopul cu cameră încorporat.

Analize statistice

Toate datele referitoare la durata larvelor, pupalei și adulților au fost analizate de ANOVA unidirecțional (Institutul SAS, 1997). În mod similar, datele colectate din analize non-enzimatice și enzimatice au fost, de asemenea, analizate în același mod. Toate mijloacele au fost separate folosind testul de comparație multiplă al lui Tukey (p Cuvinte cheie: panirbad, intermediari larva-pupali, enzime detoxifiante, hemocite, histologie a intestinului mediu, disfuncționalitate ovariană

Citare: Afraze Z, Sendi JJ, Karimi-Malati A și Zibaee A (2020) Extract metanolic de cireșe de iarnă cauzează afecțiuni morfo-histologice și imunologice în piralidul de dud Glyphodes pyloalis. Față. Fiziol. 11: 908. doi: 10.3389/fphys.2020.00908

Primit: 08 decembrie 2019; Acceptat: 07 iulie 2020;
Publicat: 07 august 2020.

Senthil-Nathan Sengottayan, Universitatea Manonmaniam Sundaranar, India

Sengodan Karthi, Universitatea Manonmaniam Sundaranar, India
Umesh Kumar Gautam, Centrul de Biologie, Academia de Științe din Republica Cehă (ASCR), Cehia