Farmacologie integrativă și regenerativă

Editat de
Paul R. Ernsberger

Facultatea de Medicină, Case Western Reserve University, Statele Unite

Revizuite de
Medardo Hernández

Universitatea Complutense din Madrid, Spania

Hong Zhan

Morgridge Institute for Research, Statele Unite

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

geroprotectoare

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Departamentul de Fizică Biologică și Medicală, Institutul de Fizică și Tehnologie din Moscova, Dolgoprudny, Rusia
  • 2 Institutul de Biologie, Centrul Științific Komi din Filiala Urală a RAS, Syktyvkar, Rusia
  • 3 Departamentul de ecologie, Universitatea de Stat Syktyvkar, Syktyvkar, Rusia
  • 4 Institutul Engelhardt de Biologie Moleculară, Academia Rusă de Științe, Moscova, Rusia
  • 5 Insilico Medicine, Inc., Universitatea Johns Hopkins, Baltimore, MD, Statele Unite

Introducere

Experimentele efectuate pe diferite organisme model au arătat că este posibilă modificarea farmacologică a activității căilor de semnalizare asociate longevității. Flavonoidele sunt un grup de compuși biologic activi naturali (Zern și Fernandez, 2005; Vauzour și colab., 2008; Kumar și Pandey, 2013; Brodowska, 2017). Efectele geroprotectoare ale diferitelor flavonoide asupra organismelor model au fost explorate în numeroase studii, dintre care majoritatea utilizează Caenorhabditis elegans ca organism model pentru a investiga efectele flavanolilor, flavonolilor și extractelor de plante (Pallauf și colab., 2017). Cu toate acestea, acest domeniu de cercetare nu a fost lipsit de certuri. Experimentele care implică utilizarea unui compus au produs rezultate inconsistente sau controversate atunci când au fost efectuate pe mai multe organisme model. De exemplu, s-a constatat că quercetina crește durata de viață a Saccharomyces cerevisiae (Belinha și colab., 2007) și C. elegans (Kampkotter și colab., 2008; Saul și colab., 2008; Pietsch și colab., 2009), dar nu au avut niciun efect asupra șoarecilor (Jones și Hughes, 1982; Spindler și colab., 2013). Aceste studii evidențiază importanța reproductibilității efectelor geroprotectoare ale unui compus între diferitele organisme model, în special având în vedere că căile de semnalizare asociate longevității sunt extrem de conservatoare din punct de vedere evolutiv (Moskalev și colab., 2016). De exemplu, durata de viață crescută a mai multor organisme a fost observată pentru medicamentul antiinflamator ibuprofen (He și colab., 2014) și imunosupresorul rapamicină (Harrison și colab., 2009; Bjedov și colab., 2010; Robida-Stubbs și colab. ., 2012).

Materiale și metode

C. elegans Analiza duratei de viață

C. elegans Analiza rezistenței la stres

Experimentele pentru evaluarea rezistenței la stres au fost efectuate în a 5-a zi de tratament cu flavonoizi. În experimentele privind stresul oxidativ, paraquat 100 mM (Methyl Viologen, Acros Organics) a fost adăugat la nematode. În experimentele de testare a șocului termic, viermii au fost încălziți la 33 ° C. Numărul de viermi morți a fost numărat după 24 de ore. Pentru fiecare tip de stres, experimentul a fost realizat în trei exemplare. Pentru fiecare grup experimental din fiecare experiment s-au utilizat 35-117 nematode, cantitatea totală din toate experimentele efectuate fiind de cel puțin 170 pentru fiecare variantă. Datele a trei experimente au fost combinate. Comparația statistică a procentului de animale moarte pentru datele combinate a fost făcută utilizând testul Fisher-test (Fisher, 1954).

D. melanogaster Analiza duratei de viață

Cantonul-S de tip sălbatic D. melanogaster (Bloomington Stock Center, Statele Unite) au fost separate prin sex și adăpostite în flacoane de 25 mm × 95 mm (30 de muște pe flacon) cu mediu de drojdie de zahăr din următoarea compoziție la 1 L: drojdie uscată - 8 g, agar - 7 g, zahăr - 30 g, gri - 30 g, acid propionic - 8 picături (Ashburner, 1989). Pentru fiecare grup experimental au fost utilizate 100-150 de muște. Muștele au fost menținute la 25 ° C cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore. Soluțiile stoc DMSO ale compușilor studiați au fost dizolvate în pasta de drojdie la concentrații finale sau 0,3, 0,5 și 1 μM. Aceste concentrații au fost alese deoarece sunt considerate fiziologice (Kanazawa, 2011). Acest amestec a fost aplicat pe suprafața mediului nutritiv începând cu prima zi de maturitate. Muștele erau transferate în sticle noi de două ori pe săptămână. Numărul muștelor moarte a fost numărat nu mai puțin de trei ori pe săptămână. Experimentul a fost reprodus de trei ori. Au fost efectuate aceleași analize statistice ca și pentru viermi.

D. melanogaster Analiza rezistenței la stres

Experimentele privind rezistența la stres au fost efectuate în a 10-a zi de tratament cu flavonoizi. Pentru fiecare grup experimental au fost utilizate 100-150 de muște. În experimentele de testare a stresului oxidativ, muștele au fost mutate în flacoane cu hârtie de filtru înmuiată într-o soluție de paraquat 20 mM (Metil Viologen, Sigma) în zaharoză 5% (0,2 ml per flacon) după 2 ore de foame. Muștele au murit de foame prin transfer în flacoane cu o hârtie de filtru saturată cu apă în locul mediului nutritiv. În experimentele privind stresul de șoc termic, flacoanele care conțin muștele și mediul nutritiv au fost încălzite la 35 ° C. Numărul muștelor moarte a fost numărat de două ori pe zi. Pentru fiecare tip de stres, experimentul a fost realizat în trei exemplare. Datele a trei experimente au fost combinate. Semnificația diferențelor dintre grupuri pentru datele combinate a fost evaluată cu testul Fisher-test (Fisher, 1954).

D. melanogaster Testul de fertilitate

Fecunditatea femelelor a fost evaluată o dată pe săptămână prin plasarea a trei femele și trei bărbați de aceeași vârstă în flacoane cu nutrienți proaspeți colorați cu cărbune activ și permițând 24 de ore pentru depunerea ouălor. După trecerea a 24 de ore, s-a numărat numărul de ouă pe femelă. Pentru fiecare variantă experimentală, au fost utilizate 50 de femele fertile. Bărbații au fost înlocuiți cu muște tinere o dată pe lună. Semnificația statistică dintre curbele cumulative a fost evaluată cu testul χ 2 utilizând programul Statistica 6.1 (StatSoft, Statele Unite) (Fisher, 1954).

D. melanogaster Testarea activității spontane

Pentru fiecare variantă experimentală, au fost selectate 30 de muște (10 muște pe flacon). Bărbații și femelele au fost analizate separat. Muștele au fost păstrate în condiții standard și transferate pe noi suporturi de două ori pe săptămână. Activitatea spontană a fost testată timp de 24 de ore în fiecare săptămână cu complexul hardware-software „Drosophila Population Monitor” (TriKinetics, Inc., Statele Unite). Analizele statistice au fost efectuate cu testul χ 2 utilizând programul Statistica 6.1 (StatSoft, Statele Unite) (Fisher, 1954).

RT-PCR

În acest test, au fost studiate numai concentrații de 0,3 și 1,0 μM ale compușilor selectați. În a 10-a zi de consum de flavonoizi, muștele au fost omogenizate. ARN-ul a fost extras folosind reactivul de liză QIAzol (Qiagen, Olanda) cu precipitații ulterioare de izopropanol. ARN-ul a fost purificat cu DNase I, kitul Amplification Grade (Life Technologies, Breda, Olanda) în conformitate cu protocolul producătorului. Sinteza ADNc a fost efectuată utilizând transcriptaza inversă Revert Aid, așa cum a recomandat Fermentas. PCR în timp real a fost efectuat pe sistemul PCR în timp real 7500 (Applied Biosystems, Statele Unite) utilizând următoarea procedură: (1) denaturare timp de 10 minute la 95 ° C, (2) denaturare timp de 15 s la 95 ° C, (3) recoacere timp de 30 s la 60 ° C, (4) alungire timp de 30 s la 60 ° C. Etapele 2-4 au fost repetate de 50 de ori.

EF1α și β-Tubulin au fost utilizate pentru normalizarea expresiei, deoarece au fost cele mai stabile dintre cele patru gene testate (Actin, RpL32, EF1α, β-Tubulin). Expresia relativă a genelor studiate a fost calculată așa cum s-a descris anterior (Zhikrevetskaya și colab., 2015). Secvențele de exemplu pentru genele studiate sunt prezentate în Tabelul 1 suplimentar.

Diferențele dintre valorile relative ale expresiei au fost considerate semnificative numai dacă au fost semnificative statistic în conformitate cu studenții t-test și cel puțin o schimbare dublă în expresia genei studiate a fost luată în considerare datorită variațiilor biologice ale nivelurilor de expresie ale genelor de referință (Log2FC> 1).

Cuantificarea expresiei genei GFP Reporter

În acest experiment, D. melanogaster linie transgenică cu GstD1-GFP a fost folosit reporter. Linia a fost oferită cu amabilitate de Dr. Tower (Universitatea din California de Sud, Los Angeles, CA, Statele Unite).

A masura GstD1-GFP expresia reporterului, muștele au fost anesteziate și fotografiate folosind un microscop fluorescent „MICMED-2 var.11” (LOMO, Rusia) și sisteme video bazate pe camera digitală Olympus C7070 (Olympus, Japonia) în a 10-a și a 30-a zi de consum de flavonoizi. Fluorescența totală a celulelor corectate (CTCF) a fost calculată utilizând software-ul ImageJ (National Institutes of Health, Statele Unite) așa cum este descris în altă parte (Cali și colab., 2015). Același test a fost efectuat la muștele tratate timp de 12 ore cu paraquat 20 mM (Metil Viologen, Sigma) în zaharoză 5% (0,2 ml per flacon). Pentru fiecare grup experimental au fost utilizate 10 muște.

Analiza asemănării la nivel de cale

Analiza căilor de semnalizare este o abordare comună pentru a obține o perspectivă din datele transcriptomice și proteomice la scară largă. Pentru a obține scoruri de activare a căilor de semnalizare (PAS), am folosit in Silicon Analiza descompunerii rețelei de activare a căii (iPANDA), pe care am aplicat-o pe seturi de date transcriptomice la scară largă ca metodă pentru dezvoltarea biomarkerului (Ozerov și colab., 2016). Spre deosebire de alte metode, iPANDA generează PAS-uri folosind date de coexpresie genică precalculate în combinație cu factori de importanță genică cuantificați în funcție de gradul de expresie diferențială a genei și descompunerea topologiei căii.

Pentru a obține PAS-uri de semnalizare, am utilizat datele de răspuns transcripțional furnizate de Proiectul 1 LINCS. Am ales probe de expresie genică a răspunsului transcripțional indus de medicament din liniile celulare A549 și MCF7. Colecția căilor de semnalizare se obține din colecția 2 SABiosciences, în care există 378 căi de semnalizare. Un total de 15.489 de compuși au fost luați în considerare. Similitudinea dintre cei doi compuși a fost măsurată ca procent din căile reglementate în mod obișnuit în sus sau în jos. Analiza similarității la nivelul căii a fost efectuată numai pentru naringină, deoarece nu există date de răspuns transcripțional pentru crisină și luteolină.

Rezultate

Efectele flavonoidelor studiate asupra C. elegans Durată de viață

Flavonoidele studiate au avut efecte pozitive asupra duratei medii de viață a nematodelor în anumite concentrații (Tabelul suplimentar 2). Cele mai pronunțate efecte ale naringinei au fost observate pentru concentrații de 5 μM (Figura 1A). Adăugarea de naringină în această concentrație a crescut durata medie de viață a viermilor cu 7,7-15,4% (p ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p 2 test.

Efectele pe care flavonoizii testați le-au avut asupra activității spontane nu au fost atât de univoce. Chiar dacă analiza statistică a relevat modificări în comparație cu muștele martor, se poate concluziona că efectele au fost în principal neutre. În timp ce acele flavonoide au crescut activitatea spontană a bărbaților și a femelelor pentru anumite intervale de timp, ele par să fi avut efecte dăunătoare în alte perioade de timp (Figura 8).

FIGURA 8. Activitatea locomotorie spontană a Drosophila melanogaster masculi (♂♂) și femele (() tratați cu naringină (A), luteolină (B), și crizină (C); ∗ p 2 test.

Efectele flavonoidelor studiate asupra expresiei genelor de răspuns la stres a muștelor

Au fost investigate efectele flavonoidelor studiate asupra expresiei genelor de răspuns la stres. Dintre 15 gene studiate, doar modificările din Hsp70 gena poate fi considerată a fi semnificativă (Figura 9). La femele, Hsp70 nivelurile de expresie au fost reduse de 2,1-5,7 ori (p ∗ p 2 test.

Efectele flavonoidelor studiate asupra căii de semnalizare Keap1/Nrf2 în muște

FIGURA 10. Fluorescența relativă a GstD1-GFP reporter în Drosophila melanogaster masculi după tratamentul cu naringină (A), luteolină (B), și crizină (C); ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p 2 test.

FIGURI 11. Fluorescența relativă a GstD1-GFP reporter în Drosophila melanogaster femelele după tratamentul cu naringină (A), luteolină (B), și crizină (C); ∗ p ∗∗ p ∗∗∗ p 2 test.

Asemănare la nivelul căii

Pentru a determina similitudinea la nivelul căii, s-a aplicat algoritmul iPANDA. Pentru fiecare compus, PAS-urile de perturbare au fost calculate pentru 378 de căi. Similitudinea dintre semnăturile de activare a căilor compușilor naturali și rapamicina a fost evaluată prin numărul de căi reglementate în mod obișnuit în sus și în jos între 15.489 de compuși. Rezultatele analizei la nivelul căii sunt prezentate în tabelele suplimentare 7, 8.

Cea mai bună similitudine (rang 348 din 15.489) a fost observată între naringină (timp de expunere 24 h, concentrație 10 μM) și rapamicină (timp de expunere 24 h, concentrație 0,4 μM) în linia celulară A549, dar în acest caz, cantitatea de frecvent căile reglementate au fost analizate doar 88 din 378. Cea mai mare cantitate de căi reglementate frecvent între naringină și rapamicină a fost de 229 și a fost observată în celulele MCF7. Cu toate acestea, atunci când se compară cu alți compuși, rangul naringinei este destul de scăzut (rang 1306 din 15.489). Astfel, se poate concluziona că naringina și rapamicina au mecanisme de acțiune destul de distincte cel puțin în celulele A549 și MCF7.

Discuţie

În anumite concentrații, compușii studiați au îmbunătățit parametrii duratei de viață a C. elegans organism model. Luteolina și crisina au îmbunătățit, de asemenea, parametrii duratei de viață a D. melanogaster femelele fără a reduce parametrii fiziologici dependenți de îmbătrânire (fecunditate și activitate locomotorie), dar nu au afectat bărbații. Naringin nu a afectat durata de viață a femeilor și, la cea mai mare concentrație (1 μM), a scăzut parametrii duratei de viață a bărbaților. În plus, flavonoidele nu au avut nici un efect, fie, în concentrații mari, au scăzut rezistența la stres a nematodelor și a muștelor.

Pentru femei, toți compușii studiați au fost asociați cu scăderea Hsp70 expresia genelor. Pentru bărbați, numai naringina a fost asociată cu scăderea Hsp70 expresia genelor. Reglementarea în jos a Hsp70 gena este un efect cunoscut al flavonoidelor precum quercetina (Tatsuta și colab., 2014), fisetina (Kim și colab., 2015) și epigalocatechin-3-galatul (Tran și colab., 2010). Proteinele Hsp70 protejează celulele de diferite tipuri de stres participând la proteostază și jucând un rol în procesele celulare, cum ar fi apoptoza sau proliferarea prin interacțiunea cu proteinele reglatoare (Mayer și Bukau, 2005; Gong și Golic, 2006). Hsp70 supraexpresia este asociată cu o durată de viață crescută la muște (Tatar și colab., 1997). Pe de altă parte, s-a observat că zboară cu niveluri mai ridicate de Hsp70-GFP reporterul mor mai repede decât muștele cu niveluri mai mici (Yang și Tower, 2009). Astfel, niveluri scăzute de Hsp70 poate fi un biomarker de vârstă biologică mai tânără.

Luteolina și crisina au două și, respectiv, zero grupări hidroxil pe inelul B. Conform literaturii, capacitatea flavonolilor, o altă subclasă de flavonoide, de a crește durata de viață a organismelor model depinde de numărul de grupări hidroxil de pe inelul lor B, mai multe grupări hidroxil fiind asociate cu efecte mai pronunțate (Grunz et al., 2012). În experimentele noastre, nu am observat diferențe drastice între efectele luteolinei și ale crisinei asupra parametrilor duratei de viață a C. elegans și D. melanogaster. Cu toate acestea, adăugarea de luteolină a dus la o scădere mai pronunțată a Hsp70 nivelurile de ARNm după 10 zile de tratament. Mai mult, spre deosebire de crisină, luteolina a scăzut, de asemenea, nivelul de GstD1-GFP gena reporter în unele cazuri. Astfel, luteolina este mai activă biologic decât crisina.

Rezultatele experimentelor noastre demonstrează capacitatea flavonelor crisină și luteolină de a îmbunătăți durata de viață a ambelor C. elegans și D. melanogaster modele biologice. Posibilul mecanism al acțiunii lor este prin activarea AMPK. Chiar dacă naringin nu a demonstrat efecte pozitive asupra duratei de viață a D. melanogaster, a produs cele mai pronunțate efecte asupra activării țintei Nrf2. Analiza datelor de răspuns transcripțional a liniilor celulare A549 și MCF7 (rezultate din proiectul LINCS) au relevat că rapamicina și naringina activează și inhibă unele căi comune de semnalizare. Cu toate acestea, majoritatea mecanismelor lor de acțiune sunt diferite.

Contribuțiile autorului

EL, EP, MV, AZ și AM au scris textul manuscris. EL, NZ, EP, AK, MV, EM și SL au efectuat experimentele și au procesat analiza statistică. AM a supravegheat cercetarea și textul manuscrisului. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.

Finanțarea

Această lucrare a fost susținută de Fundația Rusă pentru Știință (Numărul de grant/premiu: 14-50-00060).

Declarație privind conflictul de interese

Autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricărei relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretată ca un potențial conflict de interese.