* Autorul corespunzator:

Abstract

Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) se caracterizează prin acumularea excesivă de trigliceride ca picături de lipide în citoplasma hepatocitelor, care rezultă dintr-un dezechilibru între absorbția, sinteza, exportul și oxidarea acizilor grași. În acest studiu, am evaluat efectul extracte naturale din ciuperci (Agaricusbisporus) îmbogățite în ergotioneină antioxidantă, pentru reducerea acumulării de lipide în celulele HepG2. Extractele bogate în ergotionină A.bisporus (ERAbE) au scăzut concentrația intracelulară de lipide, dimensiunea picăturilor de lipide și conținutul de TG intracelular prin reglarea descendentă a SREBP1c, PPARγ și ACAT1 împreună cu supra-reglarea PAR. Aceste extracte de asemenea reglementează lipogeneza hepatică prin activarea SREBP1. Mai mult, s-a constatat că lipoliza crescută este indusă prin PPARα.

ergotionină

Prin urmare, am concluzionat că EEAb are capacitatea de a reduce semnificativ conținutul de lipide intracelulare într-un model in vitro indus de acid oleic. EEAbEdownregulatedSREBP1expresia, ducând la o inhibare a lipogenezei hepatice. Activarea lipolizei induse de PPARα este responsabilă pentru scăderea conținutului de grăsime hepatică împreună cu reducerea lipogenezei. EEAb Are un efect reglator asupra acumulării de lipide în celulele HepG2.

Cuvinte cheie

Agaricus bisporus, Ergionionină; Ciupercă; NAFLD; Steatoza

INTRODUCERE

Boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) este una dintre cele mai frecvente cauze ale bolii hepatice cronice în țările dezvoltate [1] și se caracterizează prin acumularea excesivă de grăsimi în hepatocitele parenchimului hepatic în absența consumului excesiv de alcool [2] ] .NAFLD este deosebit de răspândit la pacienții cu anomalii metabolice, cum ar fi obezitatea, diabetul de tip 2, hipertensiunea arterială și hipertrigliceridemia [3,4] și nu a fost descrisă până în prezent nicio relație între NAFLD și rasă, vârstă sau sex.

Patogeneza exactă a NAFLD rămâne slab înțeleasă. Inițial, s-a propus o ipoteză „twohit” cu o acumulare inițială de lipide în ficat (steatoză simplă), urmată de evenimente care propagă stresul oxidativ, peroxidarea lipidelor și inflamații care pot duce la steatohepatită nealcoolică (NASH), fibroză hepatică, ciroză, sau în unele cazuri carcinom hepatocelular [5,6]. Cu toate acestea, recent s-a propus o ipoteză a „loviturilor paralele multiple” care sugerează că mediatorii inflamatori ai țesutului și adiposului conduc la inflamația hepatică, care este paralelă cu mai multe evenimente din ficat, inclusiv sinteza și retenția lipidelor și fibroza [2].

În ultimul deceniu, mai multe inițiative de cercetare s-au concentrat asupra posibilelor terapii pentru ameliorarea daunelor hepatice care însoțesc NAFLD, inclusiv produse sintetice și naturale. Majoritatea strategiilor includ utilizarea de antioxidanți și sensibilizatori la insulină, precum și medicamente care reduc efectul carbohidraților și grăsimilor dietetice prin inhibarea micelizării colesterolului, lipazei pancreatice și alfa glucozidazei [7-9]. Recent, interesul pentru fitochimicale naturale deoarece agenții antiNAFLD au crescut semnificativ [10,11].

În acest context, produsele naturale din ciuperci comestibile, eiAgaricusbisporus (A. bisporus), cu proprietăți hepatoprotectoare, prezintă un interes deosebit [12,13]. și microorganisme, s-a sugerat că se acumulează în celule și în unele țesuturi care suferă un stres oxidativ ridicat, cum ar fi ficatul în NAFLD, unde ERG ar putea avea un efect protector [14].

Se știe că unul dintre principalii factori de mediu care favorizează dezvoltarea NAFLD sunt dietele bogate în grăsimi și că acest tip de diete sunt foarte frecvente astăzi în societatea noastră. Prin urmare, dezvoltarea alimentelor funcționale care ar putea reduce acumularea de grăsimi hepatice și care sunt ușor încorporate în dietă este un subiect de mare interes astăzi, deoarece acest lucru ar permite tratarea acestei patologii prin nutriție [15-17]. În acest context, s-a postulat că produsele capabile să inhibe sinteza lipidică „de novo” și absorbția lipidelor ar putea juca un rol foarte important în tratamentul eficient al NASH [18]. Prin urmare, obiectivul acestei lucrări a fost studiul efectului unui extract de ciuperci (A. bisporus) bogat în ERG asupra acumulării de grăsimi (picături lipidice) în celulele HepG2 crescute într-un mediu bogat în grăsimi (1mMOA), ca fază inițială a unui studiu mai amplu la șoareci și oameni ca o posibilă intervenție nutrițională a NAFLD.

SECȚIUNI EXPERIMENTALE

Prepararea extractelor apoase

Ciupercile albe (A.bisporus) au fost folosite ca materie primă după cultivare într-o plantă pilot la Universitatea din Sevilla (Spania), conform procedurilor standard. Toate substanțele chimice utilizate au fost de calitate analitică. Extractul apos de A. bisporus a fost obținut printr-o procedură enzimatică bazată pe protocolul descris de Cremades și colab., [19]. Pe scurt, după A. bisporushomogenizare (10g + 10ml apă distilată) și digestie enzimatică cu un amestec de enzime glucanază și chitinază (Novo Nordisk ®) la pH = 5, temperatură 55ºC și un raport enzimă/substrat de 0,1 (g/v), timp de 24 de ore, temperatura a crescut până la 90 ° C timp de 120 de minute pentru a inactiva enzimele. După răcire la temperatura camerei, pH-ul a fost ajustat la 7,0 cu NaOH 1M și centrifugat la 8000xg. Supernatantul a fost colectat și filtrat printr-o membrană de 0,2 mm, folosind filtratul ca „A. bisporusextract brut” .ERAbE a fost preparat prin fracționare UltraFiltration (UF) cu o membrană de 50 KDaUF și concentrația ultrafiltratului prin osmoză inversă [20].

Cultură de celule

Celulele HepG2 au fost cultivate în mod obișnuit în DMEM (Gibco) suplimentat cu 10% FBS și 1% penicilină și streptomicină într-un incubator sub o atmosferă de 5% CO2 la 37 ° C. Modelul de celule HepG2 al acumulării de lipide intracelulare induse de OA a fost dezvoltat așa cum a fost descris anterior de ChavesTapia și colab., [21]. Celulele HepG2 au fost cultivate cu 1mM de OA timp de 48h, prezența și absența ERAbE (0,1 mg/ml) sau a quercetinei (50µM).

Colorare cu celule roșii ulei O (ORO)

Determinarea conținutului de grăsime intracelulară

Conținutul de grăsime intracelular a fost determinat fluorimetric pe baza colorării roșu de Nil, un colorant lipofil vital utilizat pentru a eticheta acumularea de grăsime în citosol [24]. Zece mii de celule HepGe au fost crescute în 96 de godeuri de plăci, expuse la OA și tratate cu 0,1 mg/ml ERAbE și 50 uMquercetin timp de 48 de ore. Reactivul AdipoRed ™ a fost adăugat în fiecare godeu și incubat la temperatura camerei timp de 10 minute. Fluorescența de intensitate a fost cuantificată utilizând o imagine moleculară 485/572nm (Synergy HT, BioTeK) și normalizată la concentrația de proteine.

Extracția sintezei ARN și ADNc

ARN-ul total din celulele HepG2 a fost izolat utilizând reactiv TRIsure (BIO38033, Bioline Reagents Ltd., Londra, Marea Britanie) pe baza metodei de guanidină izotiocianat [25]. Retrotranscriptaza a fost efectuată utilizând SensiFAST ™ cDNA Synthesis Kit (Bioline®). Cantitatea de ARN a fost determinată utilizând un spectrofotometru NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, SUA) și calitatea a fost evaluată cu un bioanalizator Agilent 2100 (tehnologii Agilent, Waldbronn, Germania). Reacțiile au fost efectuate în plăci de 48 de godeuri în volum total de 10 μl conținând 1 μl de ADNc (100ng de ADNc), 1μl de grund specific, 3μl de H2O MilliQ ultrapură și 5μl de amestec GoTaq® qPCR Master Mix 2X (Promega®), pentru fiecare probă și placa de sondă.

Reacția în lanț cantitativă a polimerazei (qPCR)