Laboratorul de afiliere de biologie funcțională și structurală, Institutul de Științe Biologice, Universitatea Federală din Pará, Belém-Pará, Brazilia

timpul

Laboratorul de afiliere de biologie funcțională și structurală, Institutul de Științe Biologice, Universitatea Federală din Pará, Belém-Pará, Brazilia

Laborator de afiliere Farmacologie a inflamației și comportamentului, Institutul de Științe ale Sănătății, Universitatea Federală din Pará, Belém-Pará, Brazilia

Laborator de afiliere Farmacologie a inflamației și comportamentului, Institutul de Științe ale Sănătății, Universitatea Federală din Pará, Belém-Pará, Brazilia

Afilieri Laborator de farmacologie a inflamației și comportamentului, Institutul de Științe ale Sănătății, Universitatea Federală din Pará, Belém-Pará, Brazilia, Laboratorul de Farmacologie Moleculară, Institutul de Științe Biologice, Universitatea Federală din Pará, Belém-Pará, Brazilia

Departamentul de afiliere farmacologie, Centrul de Științe Biologice, Universitatea Federală Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina, Brazilia

Laboratorul de afiliere de farmacologie moleculară, Institutul de Științe Biologice, Universitatea Federală din Pará, Belém-Pará, Brazilia

Laborator de afiliere Farmacologie a inflamației și comportamentului, Institutul de Științe ale Sănătății, Universitatea Federală din Pará, Belém-Pará, Brazilia

Laboratorul de afiliere de biologie funcțională și structurală, Institutul de Științe Biologice, Universitatea Federală din Pará, Belém-Pará, Brazilia

  • Francisco Bruno Teixeira,
  • Luana Nazaré da Silva Santana,
  • Fernando Romualdo Bezerra,
  • Sabrina De Carvalho,
  • Enéas Andrade Fontes-Júnior,
  • Rui Daniel Prediger,
  • Maria Elena Crespo-López,
  • Cristiane Socorro Ferraz Maia,
  • Rafael Rodrigues Lima

Cifre

Abstract

Citare: Teixeira FB, Santana LNdS, Bezerra FR, De Carvalho S, Fontes-Júnior EA, Prediger RD, și colab. (2014) Expunerea cronică la etanol în timpul adolescenței la șobolani induce deficiențe motorii și leziuni ale cortexului cerebral asociate cu stresul oxidativ. PLoS ONE 9 (6): e101074. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101074

Editor: Viviana Trezza, Universitatea Roma Tre, Italia

Primit: 5 februarie 2014; Admis: 3 iunie 2014; Publicat: 26 iunie 2014

Finanțarea: Francisco Bruno Teixeira a fost susținut de o bursă guvernamentală braziliană/Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq). Fernando Romualdo Bezerra a fost sprijinit de un guvern brazilian/Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). R.D.P. este susținut de o bursă de cercetare de la CNPq. Autorii ar dori să mulțumească PROPESP - UFPA pentru acordarea de sprijin financiar (PAPQ). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Potrivit Organizației Mondiale a Sănătății (OMS), consumul abuziv de etanol (EtOH) este responsabil pentru peste 2,5 milioane de decese premature pe an și aproape 4% din toate decesele din întreaga lume sunt atribuite alcoolului. Proiecțiile recente au indicat că consumul de EtOH va continua să crească în deceniile următoare și că adulții tineri se află la cea mai mare creștere a ratei de creștere a consumului [1]. În acest context, ultimul sondaj național privind consumul de alcool și droguri din Brazilia [2] a indicat faptul că consumul de alcool crește, în special în rândul adolescenților, devenind o problemă gravă de sănătate.

Unele regiuni cerebrale, cum ar fi cortexul cerebral, hipocampul și cerebelul, sunt extrem de vulnerabile la expunerea cronică la EtOH și s-a constatat o reducere semnificativă a greutății și volumului creierului în rândul alcoolicilor [3] - [5]. Cu toate acestea, trebuie subliniat faptul că severitatea leziunilor cerebrale depinde de multe variabile, inclusiv profilul de consum de EtOH (cantitate, frecvență și durată), împreună cu variabilele subiectului (vârstă, sex etc.) [6] - [11].

Este bine documentat că expunerea la EtOH în timpul adolescenței produce modificări neurocomportamentale care diferă de cele observate la adulți și că modificările structurale induse de EtOH în regiuni cerebrale specifice, inclusiv cortexul cerebral și hipocampul, pot sta la baza acestor afectări cognitive și afective [12] - [14]. EtOH este mai dăunător creierului în timpul adolescenței, probabil, deoarece în această perioadă mai multe structuri ale SNC sunt în curs de maturare, cu modificări de la componentele moleculare la greutatea creierului [15]. Deși mecanismele moleculare exacte asociate cu leziuni cerebrale induse de EtOH rămân a fi elucidate, studiile anterioare au demonstrat rolul proceselor de stres neuroinflamator și oxidativ [12], [14], [16], [17].

Mai multe studii au raportat că intoxicația cronică determină o activare microgliană crescută și hipertrofie astrocitară, împreună cu eliberarea de citokine proinflamatorii [18] - [22] și că aceste evenimente pot fi asociate cu etanol indus de neurodegenerare [23].

În ceea ce privește stresul oxidativ, una dintre principalele specii reactive de azot este oxidul azotic (NO), produs de enzima oxidului azotic sintază, care este indusă în situații patologice, cum ar fi intoxicația cronică cu EtOH [24].

Prin urmare, în prezentul studiu am investigat dacă expunerea cronică severă la EtOH în timpul adolescenței poate induce tulburări motorii și leziuni histologice în cortexul cerebral al șobolanilor. De asemenea, am abordat implicarea presupusă a mecanismelor de stres neuroinflamator și oxidativ în astfel de efecte ale expunerii cronice la EtOH în adolescență.

Materiale și metode

Animale și grupuri experimentale

Un total de 20 de șobolani Wistar bărbați adolescenți (în vârstă de 35 de zile), obținuți de la Universitatea Federală din Pará (UFPA) au fost păstrați în cuști colective (5 animale pe cușcă). Animalele au fost întreținute într-o cameră controlată de climă, cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore (luminile aprinse între orele 7:00 AM) și hrană și apă ad libitum. Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul de etică pentru animalele experimentale ale Universității Federale din Pará (numărul de licență BIO- 007-09) și au urmat liniile directoare sugerate de Ghidul NIH pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Animalele au primit apă distilată pe cale orală (gavaj) sau EtOH (6,5 g/kg/zi, 22,5% g/v) (n = 10 animale) o dată pe zi, timp de 55 de zile (adică până la a 90-a zi de viață), ca descris anterior [14]. Protocolul actual de administrare a EtOH s-a bazat pe studii anterioare din grupul nostru [14] care arată că intoxicația cu EtOH (6,5 g/kg/zi) în timpul SNC în curs de dezvoltare poate induce tulburări neurocomportamentale de lungă durată și modificări histochimice ale creierului la șobolani.

Pentru a investiga efectele putative ale intoxicației cu EtOH asupra nivelurilor generale de nutriție slabă care pot afecta în mod direct performanțele motorii și leziunile corticale, greutatea corporală a animalelor a fost controlată pe întreaga perioadă (55 de zile) de expunere la EtOH (adică, din a 35-a zi până la A 90-a zi de viață) la intervale de 7 zile. Rata de supraviețuire a animalelor din fiecare grup a fost evaluată pe întreaga perioadă de protocol experimental și toate animalele au supraviețuit întregului studiu. Mai mult, toate analizele comportamentale și imunohistochimice au fost efectuate de un experimentator experimentat care nu cunoștea grupul experimental al animalelor testate.

Analize comportamentale

Douăzeci și patru de ore după ultima administrare de EtOH sau apă distilată, animalele au fost conduse la testul din cameră și aclimatizate cu cel puțin 1 oră înainte de începerea testelor comportamentale, cu atenuarea nivelurilor de zgomot și iluminare scăzută (12 lux).

Câmp deschis.

Activitatea locomotorie spontană a animalelor a fost evaluată într-o arenă de câmp deschis timp de 5 minute. Aparatul, realizat din lemn acoperit cu Formica impermeabilă, avea o podea albă de 100 × 100 cm (împărțită prin linii negre în 25 de pătrate de 20 × 20 cm) și pereți albi, 40 cm înălțime. Fiecare șobolan a fost plasat în centrul câmpului deschis și s-au înregistrat numărul de pătrate încrucișate.

Plan înclinat.

Capacitatea animalului de a menține stabilitatea posturală a fost evaluată cu testul planului înclinat. Șobolanii au fost așezați pe planul înclinat, care este ridicat în trepte de 5 grade și poate fi folosit ca un indice de rezistență a membrelor posterioare [14], [25]. Înclinarea maximă la care șobolanul și-a putut menține poziția timp de 5 s a fost înregistrată ca unghiul final. Fiecare șobolan a fost testat în cinci studii consecutive cu un interval inter-proces de 60 s, iar unghiul mediu a fost calculat.

Rotarod.

Aparatul rotarod (Insight Scientific Equipments, SP, Brazilia) constă dintr-o rolă metalică canelată (8 cm diametru) și compartimente separate de 9 cm lățime înălțate 16 cm. Ca parte a procedurii de testare, animalele au fost inițial antrenate să se mențină pe tija rotativă la 15 rotații pe minut (RPM) timp de 3 minute (faza de obișnuință). După o perioadă de 24 de ore, animalele au fost evaluate pentru capacitatea lor de a rămâne pe tija rotativă în timpul a 4 încercări succesive de 3 minute la 15 RPM cu un interval inter-proces de 60 s [14].

Evaluarea histologică

Perfuzie și imunohistochimie.

În urma testelor comportamentale, un set de animale (n = 5 animale pe grup) au fost profund anesteziate cu clorhidrat de ketamină (90 mg/kg, ip) și clorhidrat de xilazină (10 mg/kg, ip) și perfuzate transcardic cu soluție salină heparinizată de 0,9% urmată de 4% paraformaldehidă în tampon fosfat 0,2 M. Manipularea chirurgicală a fost efectuată numai după ce au fost abolite atât reflexele corneei, cât și cele ale retragerii labei. Creierele au fost îndepărtate de pe craniu și post-fixate timp de 12 ore în același fixator și crioprotejate în concentrații crescând gradiente de soluții de zaharoză-glicerol timp de 7 zile. Creierul a fost apoi înghețat în TissueTek, secțiuni coronare de 20 µm ale cortexului cerebral au fost tăiate folosind un criostat (CarlZeissMicron, Germania). Secțiunile au fost pregătite pe lamele gelatinizate uscate la aer timp de 24 de ore. Sunt depozitate într-un congelator la -20 ° C pentru analiză posterioară.

Secțiunile au fost clătite din nou timp de 5 minute (de trei ori) și incubate în complexul avidină-biotină-peroxidază (ABC Kit, Vector Laboratories, SUA) timp de 2 ore. Secțiunile au fost clătite de patru ori (câte 5 minute fiecare) și dezvăluite cu Diaminobenzidimă (DAB) [14], [26]. După reacția DAB, secțiunile au fost clătite de două ori (5 minute fiecare) în 0,1 MPB, deshidratate și acoperite cu Entellan (Merck, Germania).

Analize calitative și cantitative.

Toate secțiunile au fost inițial studiate prin microscopie cu lumină. Imagini ilustrative de la toate grupurile experimentale au fost obținute cu o cameră digitală (Moticam 2500, SUA) atașată la un microscop (Nikon, Eclipse 50i, SUA). Am folosit secțiuni coronare care conțin cortex cerebral pentru a număra numărul de neuroni (celule NeuN +), microglia (celule Iba1 +) și astrocite (celule GFAP +) folosind o reticulă pătrată de 0,0665 mm 2 atașată la ocularul microscopului (obiectivul 40x). Am numărat trei câmpuri pe secțiune și trei secțiuni pe animal pentru grupuri de control și EtOH (Fig. 1).

Analiza biochimică

După teste comportamentale, un set diferit de animale decât cel utilizat în studiile histologice (n = 5 animale pe grup) au fost sacrificate prin dislocare cervicală și creierele au fost îndepărtate imediat și răcite pe gheață uscată. Apoi, întregul cortex cerebral a fost separat de restul encefalului și omogenizat în tampon Tris-HCl 20 mM rece cu gheață (pH 7,4).

Test nitrit.

O alicotă de omogenat brut a fost centrifugată la 21.000 g timp de 20 de minute la 4 ° C, iar supernatantul a fost utilizat pentru a analiza nivelurile de nitriți așa cum este descris în altă parte [27]. Pe scurt, probele au fost incubate la temperatura camerei timp de 20 min cu reactiv Griess [0,1% N- (1-naftil) etilendiaminedihidroclorură; 1% sulfanilamidă și 5% acid fosforic; 1∶1]. Absorbanta a fost masurata la 550 nm si comparata cu cea a solutiilor standard de nitrit de sodiu.

Testul peroxidării lipidelor (LPO).

Peroxidarea lipidelor a fost evaluată prin măsurarea nivelurilor de malondialdehidă (MDA) și 4-hidroxialquenali (4HDA) așa cum s-a arătat anterior [28]. Pe scurt, o alicotă de omogenat brut a fost centrifugată la 2.500 g timp de 30 de minute la 4 ° C și supernatantul a fost procesat așa cum este descris de trusa Bioxytech LPO-568 (Cayman Chemical). Acest kit profită de un reactiv cromogen care reacționează cu MDA și 4HDA la 45 ° C, oferind un cromofor stabil cu absorbție maximă la lungimea de undă de 586 nm.

Conținutul de proteine.

Cantitățile de proteine ​​din supernatante (utilizate pentru determinarea nivelurilor de peroxidare a lipidelor și a nitriților) au fost analizate așa cum s-a descris în altă parte [29]. Astfel, după corectarea concentrației de proteine, rezultatele peroxidării lipidelor și a nivelurilor de nitriți au fost exprimate ca procente din grupele martor.

Analize statistice

Toate valorile sunt exprimate ca mijloace ± S.E.M. (n = 10 animale pe grup pentru teste comportamentale și n = 5 pe grup pentru imunohistochimie și analize biochimice). Compararea statistică a creșterii în greutate corporală între grupurile martor și EtOH a fost efectuată utilizând analiza unică a varianței (ANOVA) cu măsuri repetate (zile). Datele din testul rotarod au fost evaluate cu ANOVA unidirecțional (tratament) cu măsuri repetate (studii). După ANOVA semnificative, s-au efectuat mai multe comparații post-hoc folosind testul Tukey’s. Restul datelor au fost comparate folosind testul t Student. Nivelul de semnificație acceptat a fost a cincea zi până la a 90-a zi de viață) la intervale de 7 zile. ANOVA unidirecțională cu măsuri repetate a evidențiat efecte semnificative pentru factorul de tratament (F1,16 = 73,11; P a 77 a zi de viață (P Figura 2. Efectele administrării etanolului cronic (EtOH) (6,5 g/kg/zi) în timpul adolescenței pe o perioadă de 55 de zile (adică de la a 35-a zi până la a 90-a zi de viață) în creșterea în greutate a șobolanilor.

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM a greutății corporale cu un interval de 7 zile (n = 10 animale pe grup). * P Figura 3. Efectele administrării etanolului cronic (EtOH) (6,5 g/kg/zi) în timpul adolescenței asupra activității locomotorii la șobolani Wistar masculi evaluați în câmp deschis (OF), plan înclinat și testul rotarod.

Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM din: (A) pătrate totale traversate (test OF); (B) Unghiul de cădere (testul planului înclinat); (C) Latența va scădea în timpul a 5 sesiuni la 15 rotații pe minut (test rotarod) (n = 10 animale pe grup). * P Figura 4. Efectele administrării etanolului cronic (EtOH) (6,5 g/kg/zi) în timpul adolescenței asupra densității celulare a motorului cortexului.

Aceste rezultate sunt exprimate cu microfotografii și media ± SEM. A (martor), B (EtOH), C: microfotografii și grafic care exprimă eticheta Neu-N; D (control), E (EtOH), F: microfotografii și grafic care exprimă eticheta GFAP; G (martor), H (EtOH), I: microfotografii și grafic care exprimă eticheta Iba-1 (n = 5 animale pe grup). * P Figura 5. Efectele administrării etanolului cronic (EtOH) (6,5 g/kg/zi) în timpul adolescenței asupra parametrilor de stres oxidativ ai șobolanilor Wistar.