SCOP: Pentru a investiga potențialul efect terapeutic al exopolizaharidei (EPS) care produce Streptococcus thermophilus (S. thermophilus) CRL 1190 lapte fermentat pe gastrită cronică la șoareci Balb/c.

METODE: Șoarecii Balb/c au fost hrăniți cu lapte fermentat timp de 7 zile după inducerea gastritei cu acid acetil-salicilic (ASA, 400 mg/kg greutate corporală pe zi timp de 10 zile). Omeprazolul a fost inclus în acest studiu ca un control terapeutic pozitiv. Activitatea inflamatorie gastrică a fost evaluată din histologia gastrică și scorul de inflamație, numărul de interleukină-10 (IL-10), interferon-γ (INFγ) și factor de necroză tumorală-celule producătoare de citokine ale factorului α (TNF-α) din mucoasa gastrică, și grosimea stratului de mucus.

REZULTATE: Animale care primesc tratament cu producător de EPS S. thermophilus CRL 1190 lapte fermentat a arătat o structură de mucoasă gastrică conservată similară cu cea a animalelor sănătoase. Scorurile de inflamație ale șoarecilor tratați cu lapte fermentat au fost mai mici decât cele ale șoarecilor din grupul gastrită (0,2 ± 0,03 vs. 2,0 ± 0,6, P + (15 ± 1,0 vs. 28 ± 1,2, P + (16 ± 3,0 vs. 33 ± 3,0, P + (28 ± 1,5 vs. 14 ± 1,3, P Bacterii lactice, probiotice, gastrite, Streptococcus thermophilus, exopolizaharide

  • Citare: Rodríguez C, Medici M, Mozzi F, Valdez GF. Efectul terapeutic al laptelui fermentat Streptococcus thermophilus CRL 1190 asupra gastritei cronice. World J Gastroenterol 2010; 16 (13): 1622-1630
  • URL:https://www.wjgnet.com/1007-9327/full/v16/i13/1622.htm
  • DOI:https://dx.doi.org/10.3748/wjg.v16.i13.1622

Gastrita este o tulburare frecventă în care se observă discontinuitatea mucoasei gastrice. Este cauzat de mai mulți factori, cum ar fi alcoolul, stresul, infecția cu Helicobacter pylori (H. pylori) [1 - 3], rezultând un dezechilibru între secreția ofensivă de acid-pepsină și factorii mucoși defensivi precum secreția de mucină și vărsarea celulară [4]. Medicamentele antiinflamatoare nesteroidiene (AINS) precum acidul acetil-salicilic (ASA) sunt utilizate la nivel mondial ca agenți antiinflamatori și analgezici în tratamentul bolilor cronice precum artrita reumatoidă și osteoartrita [5], precum și pentru prevenirea a bolilor cardiovasculare. Cu toate acestea, leziunile gastro-intestinale sunt un efect advers grav al AINS care produc o gamă largă de efecte toxice în principal în stomac [6], toxicitatea ASA fiind atribuită deteriorării directe a celulelor mucoasei [7]. Mai mult, ASA afectează diverse linii de apărare a mucoasei, cum ar fi secreția de bicarbonat, sinteza mucusului, scăderea fluxului sanguin al mucoasei [8, 9] cu amplificarea procesului inflamator prin expresia citokinelor pro-inflamatorii [10] .

Printre cele mai convenționale medicamente utilizate pentru tratamentul gastritei se numără inhibitorii pompei de protoni, cum ar fi omeprazolul (OM) [11]; cu toate acestea, majoritatea acestor medicamente produc și efecte secundare nedorite și interacțiuni medicamentoase [12] .

Probioticele sunt „microorganisme vii care, atunci când sunt consumate în cantități adecvate, conferă gazdei un beneficiu pentru sănătate [13]”. Alimentele probiotice care conțin bacterii lactice (LAB) au fost utilizate în tratamentul diferitelor afecțiuni gastro-intestinale, cum ar fi ulcere gastrice și inflamații legate de H. pylori infecție, infecții gastro-intestinale sau diaree asociată cu antibiotice [14 - 16], oferind efecte benefice gazdei prin modularea funcțiilor imune, de ex. producția sistemică de citokine [17]. Sistemul imunitar al mucoasei este împărțit funcțional în locuri în care antigenii străini sunt preluați și întâlnesc celulele imune pentru a iniția răspunsul imun printr-o rețea de semnale între diferite populații de celule. Această rețea celulară este extrem de integrată prin producția de citokine și este reglementată fin de expresia selectivă a receptorilor de citokine. Subseturile de celule T-helper (Th) și modelele de citokine determină natura răspunsului imun [18] .

Unele tulpini LAB secretă polimeri exocelulari de carbohidrați numiți exopolizaharide (EPS). Există o mare diversitate de EPS din tulpinile LAB în ceea ce privește caracteristicile lor chimice, randamentul, proprietățile tehnologice și funcționale [19 - 21]. EPS joacă un rol important în industria produselor lactate, în principal în producția de iaurt și în anumite tipuri de brânzeturi, cum ar fi cheddar cu grăsimi reduse și mozzarella [22], îmbunătățind caracteristicile texturale, de topire și senzoriale ale produselor. Efectele de promovare a sănătății atribuite tulpinilor probiotice sau alimentelor provin nu numai din bacterii în sine, ci și din metaboliții produși în timpul fermentării.

EPS de la LAB a fost susținut că participă la diferite procese de reglementare, cum ar fi activitățile imunomodulatoare, de scădere a colesterolului și anti-ulcer [23, 24]. În lucrările anterioare [25], am demonstrat că șoarecii Balb/c hrăneau un lapte fermentat cu producătorul de EPS S. thermophilus CRL 1190 a fost eficient în prevenirea gastritei prin modularea răspunsului imun și menținerea stratului de mucus. Prezentul studiu a abordat potențialele aplicații terapeutice ale laptelui fermentat preparat cu ajutorul produsului EPS S. thermophilus CRL 1190 tulpină pentru tratamentul gastritei cronice asociate ASA.

S. thermophilus CRL 1190 a fost utilizat în acest studiu. Această tulpină a fost selectată anterior pentru proprietățile fizico-chimice ale polizaharidei sale [20], pentru a nu prezenta efecte secundare, cum ar fi translocația bacteriană (ficat și splină), și pentru eficacitatea sa în prevenirea gastritei induse de ASA [25]. Tulpina a fost cultivată (10 ml/L inocul) în bulion LAPTg (peptonă, 15 g/L; triptonă, 10 g/L; extract de drojdie, 10 g/L; glucoză, 10 g/L; și între 80, 1 ml/L) și subcultivat cel puțin de două ori în lapte degresat reconstituit (RSM, 100 g/L) chiar înainte de utilizarea experimentală. Tulpina a fost menținută la -20 ° C în RSM conținând 100 mL/L glicerol, 10 g/L glucoză și 5 g/L extract de drojdie.

Laptele fermentat a fost preparat în RSM steril (sterilizat la 115 ° C timp de 20 min și răcit la 37 ° C) folosind un inocul de 10 ml/L dintr-o cultură activă a tulpinii EPS + S. thermophilus CRL 1190 (denumit FM 1190), incubat la 37 ° C timp de 16 ore și menținut la 4 ° C înainte de utilizarea experimentală. Laptele nefermentat a fost folosit ca control.

Șoareci masculi Balb/c în vârstă de șase săptămâni (25-30 g) au fost obținuți dintr-o colonie închisă păstrată la facilitățile pentru animale din CERELA și menținute într-o cameră cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore la 20 ± 2 ° C. Animalele au fost adăpostite individual în cuști (20 cm × 30 cm × 15 cm) cu tavă pentru așternut (20 cm × 30 cm × 6 cm) și li s-a permis accesul gratuit la alimentația echilibrată convențională și la apă ad libitum. Toți șoarecii nu au primit hrană timp de 24 de ore înainte de testare, dar au avut acces gratuit la apă. Protocoalele pentru animale au fost aprobate de Comitetul etic pentru îngrijirea animalelor din CERELA.

Gastrita cronică a fost indusă în urma protocolului standardizat anterior în laboratorul nostru [25]. Administrarea orală de ASA (BAYER ®) furnizată în apa de băut administrată la o doză zilnică aproximativă de 400 mg/kg pe zi pentru gastrita cronică indusă de 10 d la șoarecii Balb/c (grupa gastrită, G). Doza administrată a fost de două ori mai mare decât doza analgezică pentru șoareci și a fost aplicată pentru a induce gastrita într-o perioadă scurtă de timp experimentală. Șoarecii sănătoși (H) au primit apă potabilă fără ASA în aceeași perioadă experimentală (grup de control negativ).

Pentru a evalua efectul terapeutic al FM 1190 asupra modelului gastritei cronice, animalele au fost împărțite aleatoriu în 6 grupuri (n = 5 fiecare): (1) grup H: a primit apă potabilă fără ASA timp de 10 zile; (2) Grupul G: a primit ASA timp de 10 zile așa cum s-a descris mai sus; (3) Grup FM 1190: a primit FM cu tulpina producătoare de EPS CRL 1190 timp de 7 zile după inducerea gastritei. A fost administrat FM 1190 ad libitum la o doză aproximativă de 10 8 cfu/ml; consumul zilnic de lapte fermentat a fost monitorizat și aportul a fost stabilit la 5 ml/zi; (4) Grupa Omeprazol (OM): a primit OM (utilizat ca control pozitiv în leziunile gastrice induse de ASA) la o doză zilnică de 30 mg/kg pe zi [26] timp de 7 zile după inducerea gastritei; (5) Grupul de lapte (M): a primit lapte nefermentat timp de 7 zile după inducerea gastritei; și (6) Grupa de apă (W): apă primită timp de 7 zile după inducerea gastritei (utilizată ca control negativ).

Pentru a determina dacă EPS produs de S. thermophilus CRL 1190 (EPS 1190) a avut un efect anti-gastrită, polimerul a fost izolat din culturi de lapte de 16 ore crescute la 37 ° C utilizând o tehnică deproteinizare/precipitare cu 200 g/L (concentrație finală) acid tricloracetic și raport etanol 1: 3) [20], a fost purificat în continuare așa cum s-a descris anterior [19], și liofilizat și depozitat la 4 ° C până la utilizare. EPS 1190 a fost resuspendat în RSM (M-EPS 1190) sau în apă (W-EPS 1190) și administrat la șoareci intragastric la o doză de 4 mg/kg pe zi timp de 7 zile după inducerea gastritei. Suma EPS administrată a fost calculată pe baza cantității EPS primite de animale atunci când au fost hrănite cu FM 1190.

După perioada experimentală (ziua 11 pentru grupurile 1 și 2 și ziua 18 pentru grupurile rămase), șoarecii au fost sacrificați prin dislocare cervicală și cântăriți. Stomacii au fost îndepărtați aseptic, cântăriți și clătiți de mai multe ori cu soluție salină și utilizați pentru testele descrise mai jos.

Stomacii au fost fixați în paraformaldehidă 10% în soluție salină tamponată cu fosfat 0,1 mol/L (PBS) pH 7,0 și încorporate în parafină, urmând tehnica Sainte-Marie [27]. Trei secțiuni de parafină în serie (4 μm) din fiecare probă au fost tăiate din fiecare specimen și colorate cu hematoxilină-eozină urmate de examinarea microscopică cu lumină (Leica DM LS2, Wetzlar, Germania). Caracteristicile patologice și gradul de inflamație al mucoasei gastrice au fost evaluate conform sistemului Sydney actualizat [28] prin observare microscopică fără cunoștința grupurilor experimentale și exprimate după cum urmează: aspect normal al celulelor mononucleare împrăștiate în lamina propria (același grad ca soareci sanatosi de control): nici unul = scor 0; infiltrare ușoară a celulelor mononucleare în lamina propria și submucoasă și fără eroziune în epiteliu: ușoară = scor 1; infiltrarea moderată a celulelor mononucleare în lamina propria și submucoasă și fără eroziune în epiteliu: moderată = scor 2; și infiltrarea severă a celulelor mononucleare în lamina propria și submucoasă și eroziunea în unele părți ale epiteliului: severă = scor 3.

Feliile histologice ale regiunilor antrale și corpus ale stomacului, prelucrate așa cum s-a descris anterior, au fost deparafinizate și rehidratate într-o serie gradată de etanol. După incubare la temperatura camerei timp de 30 min în 10 g/L soluție de blocare a albuminei serice bovine (Sigma Chemical Co.), feliile histologice au fost incubate la 37 ° C timp de 60 min cu iepure anti-șoarece IL-10 sau INF-γ ( Peprotech Inc., NJ, SUA) sau TNF-α (eBioscience, San Diego, CA, SUA) anticorpi policlonali. Apoi, secțiunile au fost spălate de două ori cu soluție salină și tratate cu o diluție 1/10 a unui anticorp anti-iepure de capră conjugat cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) (Jackson Immuno Research Inc., PA, SUA) la 37 ° C timp de 45 de minute; spălat din nou cu soluție salină și examinat cu un microscop cu lumină fluorescentă (Leica DM LS2). Rezultatele au fost exprimate ca număr de celule producătoare de IL-10, INF-γ și TNF-α (celule fluorescente) la 10 câmpuri (mărire × 1000) [29]. Datele au fost obținute prin numărarea a 30 de câmpuri din 3 felii histologice pentru fiecare grupă de animale.

Stratul de mucus a fost identificat prin colorare periodică acid-Schiff (PAS) [30]. Pe scurt, după deparafinare și rehidratare, secțiunile de țesut au fost oxidate în 10 mL/L acid periodic timp de 5 min. Apoi au fost clătite în apă distilată și colorate cu reactiv Schiff timp de 10 minute. După o a doua spălare cu apă distilată, secțiunile de țesut au fost contracolorate cu hematoxilină și clătite în apă curentă de la robinet. În cele din urmă, au fost deshidratați, curățați și montați. Secțiunile au fost vizualizate la microscop (Leica M LS2) și grosimea stratului secretor de mucus din corpus și mucoasa antrumă a fost evaluată cu un analizor de imagine (× 1000) și raportul dintre grosimea stratului de gel de mucus și cea a lamelei propria mucoasă a fost calculată ca procent.

Datele experimentale au fost exprimate ca media ± SD și evaluate statistic prin analiza varianței (ANOVA) cu software-ul SPSS. Date multiple de grup au fost analizate folosind ANOVA unidirecțional și testul de comparație multiplă Tukey. Diferențele au fost considerate semnificative statistic la P A: grupul H (sănătos); B: grupul G (gastrită); C: grupul FM 1190 (lapte fermentat cu Streptococcus thermophilus CRL 1190); D: grupul OM (omeprazol); E: grupul M (Lapte); F: grupul W (apă); G: Grupul M-EPS 1190 (EPS produs de S. thermophilus CRL 1190 resuspendat în lapte) a arătat structuri histologice conservate; și H: grupul W-EPS 1190 (EPS produs de Strep. termofil CRL 1190 resuspendat în apă) a prezentat infiltrații inflamatorii cronice la suprafața mucoasei (hematoxilină și eozină, microscop cu lumină, × 100).

efectul

Stomacii de la șoarecii din grupul G au prezentat o scădere semnificativă a celulelor producătoare de citokine reglatoare (IL-10 +: 14 ± 1,3 vs. 22 ± 1,7, P +: 28 ± 1,2 vs. 14 ± 1,0 și TNF-α +: 33 ± 3,0 vs. 15 ± 2,0, P Rezultatele sunt prezentate ca mijloace de 3 determinări și sunt exprimate ca numărul de celule producătoare de IL-10-, INF-γ- și TNF-α pe 10 câmpuri (mărire × 100). A P

Administrarea terapeutică a FM 1190 la șoareci a reglat procesul inflamator gastric, scăzând semnificativ numărul de celule pro-inflamatorii producătoare de citokine (INFγ +: 15 ± 1,0 vs. 28 ± 1,2, P + 16 ± 3,0 vs. 33 ± 3,0, P +: 28 ± 1,5 vs. 14 ± 1,3, P + valori ușor mai mari decât aceste 2 grupuri (28 ± 1,5 vs. 20 ± 2,9; 28 ± 1,5 vs. 22 ± 1,7, respectiv, P + și o creștere a numărului de celule producătoare de citokine pro-inflamatorii (INFγ + - și TNF-α +) similare cu cele din grupul G (Figura 3) au fost găsite în grupurile M și W, utilizate ca martori.

M-EPS 1190 dar nu W-EPS 1190 a reușit să moduleze gastrita indusă într-un mod similar cu FM 1190, arătând o scădere a numărului de celule pro-inflamatorii producătoare de citokine (INFγ +: 15 ± 2,0 vs. 28 ± 1,2, P +: 20 ± 2,6 vs. 33 ± 3,0, P +: 21 ± 2,1 vs. 14 ± 1,3, P A: Raportul de grosime al stratului de gel de mucus la mucoasa laminei proprii din corp și mucoasa antrului. B: Fotomicrografii reprezentative ale mucoasei corpusului din diferitele grupuri. Secțiunile au fost colorate folosind reactiv PAS. Valorile reprezintă media ± SE a mediei pentru 5 șoareci. A P b P

Activitatea mieloperoxidazei ca marker de infiltrare a neutrofilelor în țesutul gastric a fost testată, dar nu a putut fi utilizată ca parametru inflamator în modelul gastritei cronice, deoarece valorile obținute au fost similare cu cele ale grupurilor sănătoase (datele nu sunt prezentate).

Laptele singur, apa, omeprazolul sau laptele fermentat preparat nu au provocat nicio deteriorare în sine pe mucoasa gastrică a animalelor sănătoase.

Pentru a determina dacă efectul terapeutic obținut după administrarea FM 1190 a rezultat din prezența EPS-ului său, biopolimerul produs a fost izolat, purificat și resuspendat în lapte sau apă și testat pentru potențialul său efect terapeutic. După cum sa observat anterior [25], numai EPS dizolvat în lapte (M-EPS 1190) a prezentat un comportament similar cu laptele fermentat în raport cu profilul citokinelor și structurile histologice, sugerând că interacțiunile EPS-lapte joacă un rol major în modularea răspunsului imun și, în consecință, în efectul terapeutic observat. S-a raportat că proteinele din zer posedă funcții biologice, inclusiv activități imunomodulatoare [46], pe lângă valoarea lor nutrițională. Rosaneli și colab [47] a raportat efectul protector al concentratului de proteine ​​din zer din laptele bovin asupra leziunilor ulcerative cauzate de administrarea de indometacin. Mai mult, efectul gastro-protector al α-lactoalbuminei, una dintre proteinele majore din zer, împotriva leziunilor gastrice induse de etanol a fost demonstrat prin îmbunătățirea mecanismelor de apărare gastrică, cum ar fi sinteza și secreția mucinei în celulele producătoare de mucus [48 - 50] .

Descoperirile prezente indică faptul că laptele este fermentat cu S. thermophilus CRL 1190 și/sau EPS-ul său a fost eficient în tratamentul terapeutic al gastritei cronice prin modularea răspunsului imun al șoarecilor și prin creșterea grosimii stratului de gel de mucus gastric. Astfel, aplicarea acestui lapte fermentat și/sau EPS al acestuia constituie o alternativă naturală potențială pentru prevenirea și tratarea leziunilor gastrice asociate cu ASA.

Gastrita este o tulburare frecventă în care există discontinuitate în mucoasa gastrică. Este cauzat de mai mulți factori, inclusiv consumul intensiv de medicamente antiinflamatoare, cum ar fi acidul acetil-salicilic (ASA), utilizat în mod obișnuit în tratamentul bolilor cronice și prevenirea patologiilor cardiovasculare. Medicamentele convenționale utilizate ca terapii împotriva gastritei produc adesea efecte secundare nedorite. Administrarea de probiotice specifice oferă o nouă terapie împotriva bolilor gastrice.

Gastrita afectează 80% din populația lumii, conform datelor Organizației Mondiale a Sănătății. Utilizarea probioticelor a fost propusă pentru ameliorarea diferitelor afecțiuni ale tractului gastro-intestinal, cum ar fi boala inflamatorie a intestinului, diareea, sindromul intestinului iritabil, etc..; cu toate acestea, s-a acordat puțină atenție bolilor gastrice. Astfel, autorii au decis să investigheze efectul terapeutic al laptelui fermentat cu exopolizaharidă (EPS) care produce S. thermophilus CRL 1190 și polimerul său pe gastrita cronică indusă de aspirină la șoareci.

Această cercetare demonstrează pentru prima dată efectul terapeutic al laptelui fermentat cu tulpina producătoare de polimeri S. thermophilus CRL 1190 și/sau EPS pe gastrita cronică indusă de ASA la șoareci. Atât laptele fermentat, cât și EPS au putut modula răspunsul imun la șoareci și au crescut grosimea stratului de gel de mucus gastric. Mai mult, eficacitatea terapeutică observată a fost similară cu omeprazolul ®, un medicament comercial utilizat în mod obișnuit în tratamentul gastritei.

Laptele fermentat cu tulpina producătoare de EPS S. thermophilus CRL 1190 și/sau EPS-ul său constituie o alternativă naturală potențială pentru prevenirea și tratarea leziunilor gastrice asociate cu ASA.

EPS sunt polimeri de carbohidrați produși în mod natural de anumite bacterii, alge, drojdii și ciuperci. Acești polimeri sunt folosiți pe scară largă în mai multe industrii, în principal datorită proprietăților lor de îngroșare, texturare și gelificare.

Cercetarea este un studiu bine realizat.

Evaluator coleg: Shashi Bala, dr., Post-doctorand asociat, Departamentul de Medicină, LRB 270L, 364 Plantation street, UMass Medical School, Worcester, MA 01605, Statele Unite

S- Editor Wang YR L- Editor Cant MR E- Editor Ma WH