I. M. Rybakowska

1 Departamentul de Biochimie și Fiziologie Clinică, Universitatea Medicală din Gdansk, Debinki 1, 80-211, Gdansk, Polonia

R. Milczarek

2 Departamentul de Biochimie Farmaceutică, Universitatea de Medicină din Gdansk, Gdansk, Polonia

E. M. Slominska

3 Departamentul de Biochimie, Universitatea de Medicină din Gdansk, Gdansk, Polonia

R. T. Smolenski

3 Departamentul de Biochimie, Universitatea de Medicină din Gdansk, Gdansk, Polonia

Abstract

Se știe puțin despre efectele cafelei care nu au legătură cu prezența cofeinei. Scopul studiului a fost de a analiza modificările funcției renale și ale metabolismului nucleotidic legate de aportul mare de cafea decofeinizată. Șoarecii au consumat extract de cafea decofeinizată timp de două săptămâni. Activitățile de AMP deaminază, ecto5'-nucleotidază, adenozin deaminază, purină nucleozid fosforilază au fost măsurate în cortexul renal și medulla prin analiza conversiei substraturilor în produse utilizând HPLC. Concentrația nucleotidelor în cortexul renal, medulla renală și ser a fost estimată prin HPLC. Activitatea ecto5'-nucleotidazei a crescut de la 0,032 ± 0,006 la 0,049 ± 0,014 nmol/mg țesut/min în cortexul renal al șoarecilor cărora li s-a administrat doză mare de cafea decofeinizată (HDC) împreună cu creșterea concentrației de adenozină în cortex și scăderea concentrației plasmatice a creatininei. HDC duce la creșterea activității ecto5'-nucleotidazei în cortexul renal care se traduce prin creșterea concentrației de adenozină. În mod surprinzător, acest lucru a determinat îmbunătățirea funcției de excreție renală.

Introducere

Se estimează că peste 59% dintre adulții din Statele Unite consumă băuturi cu cafea și în mod similar în alte țări dezvoltate [1]. În timp ce consumul de cafea este predominant, aproximativ 15% din S.U.A. populația a încetat să bea cafea cu totul, invocând îngrijorări cu privire la sănătate, reducerea cafelei a fost o strategie de prevenire a simptomelor tractului urinar, cum ar fi sindromul durerii vezicii urinare [1]. Există rapoarte de studii randomizate controlate privind consumul cronic de cafea care au confirmat o creștere mică, dar semnificativă statistic, a tensiunii arteriale sistolice și a tensiunii arteriale diastolice [2].

Deși consumul de cofeină în intervalul de 200-300 mg crește nivelul urinar de calciu atât la persoanele mai tinere, cât și la persoanele în vârstă, predominanța datelor sugerează că cofeina are un impact mai mare asupra metabolismului calciului și a oaselor la persoanele în vârstă [3]. În timp ce aportul de cofeină poate crește excreția de calciu în urină, băuturile care conțin cofeină au fost asociate cu un risc mai mic de nefrolitiază. Aportul de cafeină este asociat cu un risc mai mic de apariție a pietrelor la rinichi [4].

Efectele cafelei asupra metabolismului și genotoxicității carcinogenului alimentar au fost, de asemenea, investigate. Cafeaua a crescut expresia CYP1A2 de 16 ori în grupul tratat cu cafea de 5% și aproximativ jumătate din acest efect inductiv a fost atribuit cofeinei. Cafeaua a crescut, de asemenea, expresia enzimelor implicate în detoxifierea agenților cancerigeni din dietă, cum ar fi glutation S-transferaza alfa [5]. Există unele dovezi că cofeina crește ușor riscul de cancer la organele majore [6], dar există, de asemenea, descoperiri care arată că cafeaua poate exercita un efect protector împotriva cancerului colorectal [7-9]. Există, de asemenea, unele dovezi că cafeaua are ca rezultat o creștere a unor markeri de inflamație.

Aportul de cafea decofeinizat a fost asociat cu o scădere mică și irelevantă din punct de vedere clinic a tensiunii arteriale diastolice medii [10]. Cafeaua și cafeaua decofeinizată au capacitatea de a îmbunătăți performanța în timpul unui protocol de exerciții de rezistență [11]. Alți compuși în loc de cofeină, inclusiv polifenoli sau altele, pot fi benefice sau dăunătoare [12]. Datorită apariției a numeroși antioxidanți polifenolici naturali în cafea și ceai, aceste băuturi au atras atenția ca un posibil mijloc sigur de protejare împotriva speciilor reactive de oxigen [13]. O serie de alimente și băuturi conțin izotiocianați, polifenoli, diterpene și alte componente despre care s-a raportat că induc glutation S-transferaze, enzime care detoxifică o gamă largă de contaminanți dietetici și de mediu [14-16]. Trebuie avute în vedere efectele compușilor activi din cafeaua decofeinizată asupra funcției rinichilor.

Nucleotidele construiesc ADN, ARN și alte molecule importante precum coenzimele, ATP cu legături energetice ridicate. Rolul fiziologic al reacției catalizate de metabolismul enzimelor nucleotidice AMP deaminază (AMPD) și ecto5'-nucleotidază (e5NT), adenozin deaminază (ADA) în rinichi este în principal reglarea bazinelor de adenină nucleotidă din celulă și controlul concentrației adenozinei. Este bine dovedit că cofeina poate afecta receptorii adenozinici ca antagonist al receptorilor și inhibă, de asemenea, fosfodiesteraza responsabilă de transformarea AMPc în AMP. AMPc reglează printre altele lipaza sensibilă la hormoni a triacilglicerolului în țesutul adipos [17, 18]. Dovezile sugerează că receptorii de adenozină inhibă lipoliza prin scăderea activității adenilat ciclazei, ceea ce face din receptorii de adenozină o țintă potențială în obezitate și diabet [17]. Receptorii adenozinei sunt localizați în întregul corp, dar în principal pot fi găsiți în creier, inimă, vasele de sânge, rinichi și țesutul adipos. Spre deosebire de efectul cafelei legat de cofeină, se știe puțin despre efectul altor compuși decât cafeina prezenți în cafea.

Scopul acestui studiu a fost de a evalua efectul cafelei decofeinizate asupra enzimelor de conversie a nucleotidelor, a nivelului de adenozină și a echilibrului energetic din rinichi și a relației sale cu aspectele de bază ale funcției renale.

Materiale și metode

Pregatirea cafelei

Cafeaua espresso a fost preparată din 7 g pudră de cafea decofeinizată în 25 ml de apă cu aparat de cafea de înaltă presiune. 0,33 ml de cafea cu cofeină și 0,33 ml de cafea decofeinizată au fost diluați la 5 ml de apă pentru doza zilnică, respectiv, de cafeină (Caff) și cafea decofeinizată cu doze mici (LDC) pentru șoareci. 3,3 ml de extract de cafea decofeinizat s-au diluat la 5 ml de apă, ceea ce reprezenta doza zilnică mare aproximativă pentru șoareci - HDC.

Animale

Studiul a fost aprobat de Comitetul de etică pentru experimentele pe animale de la Universitatea Medicală din Gdansk - 29/2012. Șoarecii în vârstă de trei luni C57/BL-6 au fost tratați timp de două săptămâni fără limitare (aproximativ 5 ml/zi/șoarece) cu apă sau soluție de cafea cu cofeină (Caff), cafea decofeinizată cu doze mici (LDC) și doză mare extract de cafea decofeinizată (HDC). Extractul de cafea conține de la 0,68 la 6,8 mg cafea dizolvată pe ml, respectiv, pentru Caff, LDC și pentru HDC. După această perioadă, șoarecii au fost anesteziați cu 2,5 pg xilazină și 43 pg ketamină/g greutate de șoareci și au fost colectate organe. Sângele a fost colectat din vena cavă. Pentru determinarea nucleotidelor, un rinichi a fost înghețat cu clești pre-răcite în azot lichid, iar pentru determinarea activității, rinichiul a fost împărțit în cortex și medular și apoi înghețat.

Măsurarea concentrațiilor de nucleotide

Rinichii au fost liofilizați, separați în cortex și în medulă și apoi s-au extras cu un volum de 25 de ori în HCI04 0,4 ​​M. După aceea, probele au fost centrifugate timp de 5 minute la 14.000 rpm la 4 ° C. Supernatantul a fost neutralizat cu KOH 2 M și apoi incubat timp de 10 minute în gheață. Supernatantul obținut după 5 min de centrifugare la 14000 rpm la 4 ° C a fost analizat prin HPLC. Serul a fost extras în același volum de 1,3 M HCI04, apoi centrifugat și supernatant neutralizat cu 3 M K3PO4. După centrifugare, supernatantele au fost analizate prin HPLC.

Măsurarea activităților enzimatice ale metabolismului nucleotidic

Activitățile AMP deaminazei (AMPD), ecto5-nucleotidazei (e5NT), adenozin deaminazei (ADA), purinei nucleozid fosforilazei (PNP) au fost măsurate prin determinarea produselor de reacție cu HPLC așa cum s-a descris mai înainte [19].

Rinichii au fost omogenizați la 4 ° C în 9 volume de tampon (150 mM KCI, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, 1 mM ditiotreitol, pH 7,0). O porțiune de omogenat brut a fost luată pentru determinarea 5NT după 1 oră la 4 ° C. Omogenatul rămas a fost centrifugat la 3400 rpm la 4 ° C timp de 10 min și apoi adăugat în volum 50 tol la specificul pentru tamponul enzimatic particular și incubat cu 50 pl de substrat adecvat pentru tampon enzimatic la 37 ° C. Tamponul pentru determinarea AMPD a constat din 20 mM TRIS, 150 mM KCl, 1 mM ditiotreitol, pentru determinarea 5NT a constat din 50 mM TRIS, 5 mM MgCl2, 10 mM β glicerolfosfat, 0,1% TRITON X-100. Tamponul pentru determinarea ADA a constat din 50 mM TRIS, iar pentru PNP a constat din 50 mM NaH2PO4. Concentrațiile substratului au fost 25 mM AMP pentru AMPD, 1 mM adenozină pentru ADA, 1 mM inozină pentru PNP și 0,2 mM AMP pentru 5NT. Reacția a fost încheiată prin adăugarea a 100 1,3 l 1,3 M HCI04 și după centrifugare neutralizată la pH 6-7 cu K3PO4 3 M. Extractele centrifugate au fost analizate prin HPLC [20].

analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie ± deviație standard (SD). Valorile au fost comparate cu Anova unidirecțională a varianței (ANOVA). Testul post hoc al lui Tukey a fost utilizat pentru determinarea ulterioară a semnificației diferențelor care au fost considerate semnificative la p 1). Concentrația bazei de nucleotide adeninice nu s-a modificat între grupurile din cortexul renal și medulla (Fig. 2 a). Concentrația de adenozină (Ado) a crescut de două ori la șoarecii cu cortex renal care consumă cafea decofeinizată cu doze mari (HDC) și a crescut, de asemenea, dar a fost mai mică în grupul Caff și LDC. Astfel de modificări ale concentrației de adenozină nu au fost observate la nivelul rinichiului (Fig. 2 b). Mai mult, concentrația IMP și a inozinei nu s-a modificat în grupul HDC, ci a crescut în grupul Caff în medulă (Fig. 2 c, d). Am observat creșterea concentrației de inozină în grupul Caff și LDC în cortex și creșterea dublă a grupului Caff în medulă (Fig. 2 d).

asupra

Volumul de lichid ingerat în C (apă), cafea cu cafeină, cafea decofeinizată cu doze mici LDH sau grupuri de cafea decofeinizată cu doze mari HDC. Valorile sunt medii ± SD, n = 6, * p # p # p 3 a). Am observat o creștere a ecto 5'-nucleotidazei (e5NT) în cortexul renal al șoarecilor HDC și o creștere mai mare a grupului Caff și LDC și o relație inversă în medula renală: b). Activitățile adenozin deaminazei (ADA) au crescut în grupul cortex Caff și LDC (Fig. 3 c). De asemenea, am observat o creștere a activității purinei nucleozid fosforilazei (PNP) la șoarecii Caff din medulă, respectiv, la grupul LDC și HDC (Fig. 3 d).

Concentrațiile de A nucleotidă de adenină, b adenozină, c inozină, d hipoxantină, e xanthine f acid uric, g creatinină serică; Șoarecii de control C au băut apă, șoarecii Caff au băut cafea cu cofeină, șoareci LDC cafea decofeinizată cu doze mici, șoareci HDC tratați cu cafea decofeinizată cu doze mari. Valorile sunt medii ± SD, n = 6, b * p # p # p # p ([ATP] + 1/2 [ADP])/([ATP] + [ADP] + [AMP]) potențial de fosforilare ([ATP]/([ADP] × [Pi]) ) și hidroliza energiei libere a ATP [20, 22]. În rinichi, ciclul nucleotidic al purinei joacă un rol fundamental în protejarea inelului purinei împotriva degradării. De asemenea, este responsabil pentru generarea de amoniac și fumarat, ceea ce crește eficiența și relația dintre glicoliză și ciclul Krebs. Mai mult, reglează nivelul de AMP, care este principala sursă de adenozină în rinichi [23]. Concentrațiile de nucleotide adeninice (ATP + ADP + AMP) nu s-au modificat în cortex și în medulă, dar au modificat activitatea AMPD în grupul Caff și LDC în cortex in vivo după ce au băut cafea.

Activitatea PNP, enzima care metabolizează inozina în hipoxantină, a scăzut ușor la șoarecii renali și la șoarecii HDC medulari, ceea ce se reflectă în tendința de creștere a concentrației de inozină și scăderea hipoxantinei. Cu toate acestea, am observat o tendință de creștere a activității PNP în cortex și creșterea grupului Caff cu creșterea concentrației de hipoxantină în comparație cu grupul HDC. Creșterea activității PNP în grupul Caff la rinichi nu a fost în concordanță cu modificările concentrației de inozină care cresc. Cu toate acestea, acest lucru ar putea fi rezultatul unei activități ADA mai mari.

Un studiu anterior a demonstrat că hiperfiltrarea, care este un marker precoce al nefropatiei diabetice, este asociată cu o capacitate mai mare a rinichilor de a produce și excreta adenozină [24, 25]. Hiperfiltrarea este o acțiune a factorului natriuretic atrial (ANF) și a glucagonului. Au existat studii care utilizează adenozin deaminază, care transformă adenozina în inozină, pentru a elimina efectele adenozinei intrarenale asupra hiperfiltrării glomerulare. Rezultatele au arătat că la șobolanii tratați cu ADA, ANF și glucagon cresc filtrarea glomerulară (GFR) în mod dramatic, în timp ce tratamentul numai cu ADA nu a prezentat modificări în GFR și în fluxul plasmatic renal. Se crede că adenozina endogenă renală previne hiperfiltrarea care este cauzată de ANF și glucagon [16]. Este posibil ca cafeaua decofeinizată și cofeina să provoace o creștere a filtrării și producției de adenozină (Fig. 2 b). Concentrația mai mică de adenozină în rinichiul Caff și cortexul LDC decât în ​​HDC poate fi rezultatul unei activități mai mari de ADA care determină creșterea inozinei în grupul Caff. Adenozina este metabolizată rapid, astfel încât concentrațiile sale serice (Fig. 4 b) pot să nu reflecte concentrația sa in vivo în sângele circulant.

Rezultatele acestui studiu au demonstrat că consumul ridicat de cafea decofeinizată crește formarea de adenozină în cortexul renal pe calea ecto5'-nucleotidazei. Aceasta a fost asociată cu creșterea excreției de creatinină.

Mulțumiri

Această lucrare a fost susținută de Universitatea Medicală din Gdansk (Grant nr. ST-534).