Antimicrobiene, rezistență și chimioterapie

Editat de
Patrick R. Butaye

Școala de Medicină Veterinară a Universității Ross, Saint Kitts și Nevis

Revizuite de
Catherine M. Logue

Universitatea din Georgia, Statele Unite

JEROEN DEWULF

Universitatea din Gent, Belgia

Afilierile editorului și ale recenzenților sunt cele mai recente oferite în profilurile lor de cercetare Loop și este posibil să nu reflecte situația lor în momentul examinării.

frontierelor

  • Descărcați articolul
    • Descărcați PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Suplimentar
      Material
  • Citarea exportului
    • Notă finală
    • Manager de referință
    • Fișier TEXT simplu
    • BibTex
DISTRIBUIE PE

Cercetare originală ARTICOL

  • 1 Microscopie avansată cu lumină și electronică (ZBS-4), Institutul Robert Koch, Berlin, Germania
  • 2 Institutul de Microbiologie și Epizootie, Centrul de Medicină Infecțioasă, Freie Universität Berlin, Berlin, Germania
  • 3 Microbian Genomics (NG1), Institutul Robert Koch, Berlin, Germania
  • 4 agenți patogeni nosocomiali și rezistențe la antibiotice, Institutul Robert Koch, Wernigerode, Germania
  • 5 Institutul pentru Epidemiologie Veterinară și Biostatistică, Freie Universität Berlin, Berlin, Germania
  • 6 Institutul Robert Koch, Berlin, Germania

Introducere

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) sunt asociate în mod obișnuit cu diareea după înțărcare (PWD) la purcei, o boală care cauzează pierderi grave în industria porcinelor la nivel mondial (Fairbrother și colab., 2005; Rhouma și colab., 2017a). În prezent, sunt utilizate diferite strategii pentru a reduce costurile economice asociate ETEC în creșterea porcilor, inclusiv tratamentul oral cu sulfat de colistină în unele regiuni ale lumii (Rhouma și colab., 2017b), vaccinarea (Moon și Bunn, 1993; Blázquez și colab., 2018) și probiotice (Li și colab., 2018; Yan și colab., 2018). În plus, suplimentarea dietetică cu oxid de zinc la nivel înalt este utilizată împotriva PWD în sectorul producției de porci (Fairbrother și colab., 2005; Vahjen și colab., 2011; Bednorz și colab., 2013; Starke și colab., 2014; Pieper și colab. al. al., 2015; Kloubert și colab., 2018).

Cu toate acestea, în special efectele dietelor bogate în zinc asupra populațiilor de bacterii intestinale porcine E coli, nu sunt încă pe deplin înțelese. Zincul este al doilea metal de tranziție cel mai abundent în majoritatea filelor și este considerat în general esențial pentru viață. Împreună cu cuprul, este un oligoelement important necesar funcției hormonale, reproducerii, sintezei vitaminelor, formării enzimelor și promovează o funcție puternică a sistemului imunitar (Yu și colab., 2017). Ambele metale sunt de obicei adăugate la hrana animalelor în cantități necesare funcției fiziologice a corpului (Yazdankhah și colab., 2014; Yu și colab., 2017).

Ca cation bivalent (Zn 2+), zincul joacă un rol important ca cofactor catalitic și structural în practic toate aspectele metabolismului celular (Vallee și Auld, 1990). Păstrarea unei homeostazii intracelulare echilibrate a zincului este o condiție prealabilă pentru mamifere și majoritatea speciilor bacteriene (Nies și Grass, 2009). Prin urmare, cantitățile de zinc din celule sunt foarte reglementate, deoarece privarea de zinc împiedică creșterea bacteriană, în timp ce un exces de zinc ar putea fi toxic (Gielda și DiRita, 2012). Factorii raportați pentru creșterea nivelului de toleranță la zinc în E coli descrise până acum includ facilitatorul difuziei cationice (CDF) ZitB, P1b-tip ATPaza ZntA și transportorul fosfat anorganic cu afinitate redusă Pit (Beard și colab., 2000; Grass și colab., 2005; Deus și colab., 2017; Hoegler și Hecht, 2018).

Până în prezent, o toleranță crescută față de (urme) de metale, inclusiv zincul, este în mod clar legată de gene care conferă rezistență la antibiotice la diferite specii bacteriene (Cavaco și colab., 2011; Agga și colab., 2014; Medardus și colab., 2014; Becerra -Castro și colab., 2015; Song și colab., 2017; van Alen și colab., 2018), indicând posibil un efect co-selectiv îngrijorător al utilizării masei de oxid de zinc (Seiler și Berendonk, 2012; Bednorz și colab., 2013 ).; Yazdankhah și colab., 2014; Ciesinski și colab., 2018). În consecință, actuala contaminare antropică a mediului cu metale grele este considerată o problemă gravă (Seiler și Berendonk, 2012).

În E coli, o rețea extinsă, fin reglată de pompe de eflux, liganzi și factori de transcripție este implicată în osmoadapția intracelulară și detoxifierea metalelor grele, care garantează, de asemenea, menținerea homeostaziei celulare a zincului (Hantke, 2005; Nies și Grass, 2009; Porcheron și colab., 2013; Watly și colab., 2016). Studii recente au arătat că nivelurile de toleranță la zinc diferă nu numai între speciile bacteriene, ci și în cadrul anumitor specii, inclusiv E coli de origine umană și aviară (Deus și colab., 2017; Stocuri și colab., 2019).

Scopul acestei lucrări este de a studia efectele dietelor bogate în zinc asupra unei colecții reprezentative selectate de intestine E coli obținut de la purcei după înțărcare, luând în considerare o asociere presupusă a unui exces nutritiv de oxid de zinc și (i) niveluri fenotipice de toleranță la zinc, (ii) profiluri de susceptibilitate la antibiotice și biocide și (iii) gene implicate în rezistența antimicrobiană, zinc (metal greu )) - și toleranța la biocide.

Materiale și metode

Selecția dimensiunii eșantionului și izolarea

Setul reprezentativ al E coli izolatele investigate aici au fost selectate pe baza unui studiu anterior de hrănire (Ciesinski și colab., 2018) efectuat în conformitate cu principiile Declarației de la Basel, în conformitate cu orientările instituționale și naționale pentru îngrijirea și utilizarea animalelor. Protocolul a fost aprobat de biroul local de sănătate și securitate tehnică la locul de muncă „Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin” (LaGeSo Reg. Nr. 0296/13) așa cum s-a descris anterior (Ciesinski și colab., 2018).

Pe scurt, 32 de purcei landrace înțărcați în ziua 25 ± 1 au fost separați în două grupuri timp de 4 săptămâni: primul grup de purcei, denumit aici ca grupul cu conținut ridicat de zinc (HZG) a fost hrănit cu o dietă suplimentată cu o cantitate relativ mare de zinc oxid (2.103 mg zinc/kg dietă), în timp ce al doilea grup a servit drept control. Acest grup de control (CG) a primit o dietă obișnuită de purcei care conține o concentrație fiziologică de oxid de zinc (72 mg zinc/kg dietă) pentru a evita malnutriția urmei metalice (Ciesinski și colab., 2018). Procesul a început cu 32 de purcei, care au fost sacrificați la mijlocul procesului (38 ± 2 zile, n = 16) și la sfârșit (52 ± 2 zile, n = 16).

Aici ne concentrăm asupra E coli obținute din probe de porci sacrificați la sfârșit (n = 16; 52 ± 2 zile) numai din procesul de hrănire. În total, 817 E coli colectate din fecale, probe de digestă și mucoasă obținute de la acești 16 porci finali au fost depozitați în stocuri de glicerină la -80 ° (Ciesinski și colab., 2018). Folosind meta date cum ar fi locul de prelevare, grupul de hrănire și evaluarea creșterii pe plăci care conțin diferite antibiotice care erau disponibile pentru toate cele 817 E coli obținut din această abordare inițială (Ciesinski și colab., 2018) am selectat o probă aleatorie stratificată cuprinzând 179 de izolate (Tabelul 1 și Tabelul suplimentar S1).

tabelul 1. Distribuția de E coli printre locurile de prelevare, grupuri de hrănire, porci, MIC-uri ZnCl2 și profiluri de rezistență la antibiotice.

Caracterizarea fenotipului porcinului E coli

A fost efectuată o analiză de microdiluție a bulionului pentru biocide și săruri de metale grele utilizând plăci de microtitrare (Merlin, Bornheim-Hersel, Germania) așa cum s-a descris anterior (Deus și colab., 2017) incluzând clorhidrat de alchil diaminoetil glicină [ADH], clorură de benzetoniu [BEN ], clorură de benzalconiu [BKC], clorhexidină de guanidină [CHX], compus acridinic acriflavină [ACR], sulfat de cupru [COP], azotat de argint [SIL] și clorură de zinc [ZKC]. E coli tulpinile ATCC25922 și ATCC10536 au fost utilizate pentru controlul intern al calității. în plus, E coli tulpina RKI6122 a fost utilizată ca referință pentru creștere în prezența a 1024 μg ZnCl2/ml (Deus și colab., 2017).

Testarea susceptibilității antimicrobiene (AST) utilizând sistemul VITEK ® 2 (BioMérieux, Germania; cartela AST GN38) a fost efectuată incluzând amikacină, amoxicilină/acid clavulanic, ampicilină, cefalexină, cloramfenicol, enrofloxacină, gentamicină, marbofloxacimmy tetcilină, piperacilină/sulfam standardele date de CLSI VET01-A4 și M100-S21) (Institutul de standarde clinice și de laborator, 2012, 2013).

Caracterizarea moleculară a E coli

Sute șaptezeci și nouă E coli au fost secvențiate utilizând secvențierea genomului întreg (WGS) Illumina MiSeq ® 300 bp cu o acoperire obținută> 90X. ADN-ul plasmidic al E coli RKI3099, un izolat reprezentând un fond genomic frecvent asociat cu toleranță crescută la zinc împreună cu rezistența antimicrobiană (Tabelul suplimentar S1), a fost izolat folosind Qiagen Plasmid Mini Kit conform instrucțiunilor producătorului. ADN-ul plasmidic purificat a fost secvențiat folosind platforma Pacific Biosciences RS II cu chimia P6C4 într-o singură celulă de flux. Secvențierea Pacific Biosciences a fost finalizată prin generarea unei biblioteci de secvențiere de la 5 la 20 kb utilizând metode standard. Datele brute PacBio și citirile scurte Illumina au fost asamblate hibrid folosind unicycler v4.4 (Wick și colab., 2017). Au fost folosite citiri ajustate prin adaptor de novo asamblarea în secvențe contigue (contigs) și ulterior în schele folosind SPAdes v3.11. Toate genomele proiectate au fost adnotate folosind Prokka (Seemann, 2014).

În studiile anterioare, factorii au fost descriși ca fiind capabili să confere niveluri ridicate de toleranță la zinc în E coli (Grass și colab., 2005; Deus și colab., 2017; Vidhyaparkavi și colab., 2017; Stocks și colab., 2019). În consecință, am analizat prezența sau absența unui set larg de gene implicate în homeostazia zincului (n = 35) inclusiv metalloenzimele care leagă zincul (n = 69) (Tabel suplimentar S2).

Deoarece co-selectarea rezistenței la antibiotice și a metalelor este o problemă de maximă importanță, iar genele de rezistență la metal sunt adesea co-localizate pe elemente genetice mobile (MGE) alături de gene de rezistență la antibiotice (ARG) (Baker-Austin și colab., 2006; Fard și colab., 2011; Holzel și colab., 2012; Fang și colab., 2016; Song și colab., 2017; Argudín și colab., 2019), am investigat în continuare apariția genelor cunoscute a fi asociate cu oricare dintre antibiotice- sau rezistență la metal pe elemente genetice mobile din colecția noastră de izolate (Tabelul suplimentar S1).

O investigație suplimentară a inclus screeningul a 203 de gene descrise de Pal și colab. (2013), cunoscut în special pentru a fi asociat cu o toleranță crescută sau chiar rezistență la diferite biocide, de exemplu compusul acridinic acriflavină [ACR], clorură de benzalconiu [BKC] și clorură de benzetoniu [BEN]. Procedura de screening a inclus, printre altele qacE, varianta sa qacE (Δ1), qacL, sugE, ygiW, ymgB (tabelul suplimentar S3) și operonii suplimentari despre care se știe că sunt implicați în detoxifierea metalelor grele (arsABCD, cusABCF, merRT, pcoABCDE, pcoRS, silABCEFP, silRS, terBCDWZ, ygiW) alături de genele lor reglatoare (tabelul suplimentar S3).

prin urmare, in Silicon screening-ul întregului genom pentru toate aceste gene asociate cu rezistența la antibiotice (ARG) [n = 2570 variante incluse de ARG-uri], rezistența la biocide sau toleranța la metalele grele a fost realizată utilizând o conductă BLAST internă cu pragul general de identitate 95% ID și 90% lungime minimă pe baza ResFinder 3.1 (Zankari și colab., 2012), CARD (Baza de date de rezistență la antibiotice cuprinzătoare, Jia și colab., 2017) și BacMet (Baza de date a genelor cu rezistență la biocide și metale; Pal și colab., 2013).

Datele de screening al genomului întreg au fost utilizate pentru caracterizarea ulterioară a genotipului, inclusiv determinarea tipului de secvență multilocus (ST) utilizând MLSTFinder 2.0 (Larsen și colab., 2012), predicția serotipului (SerotypeFinder 2.0, Joensen și colab., 2015) și apariția grupurilor de incompatibilitate cu plasmide. cu PlasmidFinder 2.0 cu un prag de 95% ID (Carattoli și colab., 2014). O prezentare detaliată a tuturor izolatelor și caracteristicilor este furnizată în tabelul suplimentar S1.

Secvențe de genom întregi pentru toți 179 E coli sunt depuse în NCBI-Genbank și numerele de acces sunt furnizate în tabelul suplimentar S4.

Analize statistice

Datele au fost analizate folosind software-ul SPSS versiunea 25.0 (IBM, New York, NY, Statele Unite). P-valori Cuvinte cheie: Escherichia coli, zinc, rezistență antimicrobiană, porc, toleranță la metalele grele

Citație: Johanns VC, Ghazisaeedi F, Epping L, Semmler T, Lübke-Becker A, Pfeifer Y, Bethe A, Eichhorn I, Merle R, Walther B și Wieler LH (2019) Efectele unui oxid de zinc cu doză mare de patru săptămâni Dieta suplimentată pe comensal Escherichia coli de porci înțărcați. Față. Microbiol. 10: 2734. doi: 10.3389/fmicb.2019.02734

Primit: 16 iulie 2019; Acceptat: 11 noiembrie 2019;
Publicat: 28 noiembrie 2019.

Patrick Rick Butaye, Școala de Medicină Veterinară a Universității Ross, Saint Kitts și Nevis

Jeroen Dewulf, Universitatea din Gent, Belgia
Catherine M. Logue, Universitatea din Georgia, Statele Unite