Contribuție de M. Daniel Lane

inhibitor

Abstract

Hipotalamusul joacă un rol important în echilibrul energetic al animalelor superioare. Centrii neuronali din cadrul hipotalamusului monitorizează și integrează semnalele periferice care reflectă „starea energiei” și răspund prin eliberarea de neuropeptide orexigenice și anorexigenice (1). Remarcabil printre acești centri este nucleul arcuat, care posedă NPY și AgRP (orexigenic) și POMC și CART (anorexigenic) care exprimă neuroni care posedă receptori pentru hormoni peptidici, inclusiv insulină, leptină și factor neurotrofic ciliar, despre care se știe că afectează comportamentul de hrănire (1)., 2). Acești neuroni se proiectează către alte centre din hipotalamus care reglează aportul și cheltuielile de energie (1).

Dovezi din ce în ce mai mari (3) sugerează că există o legătură între metabolismul energiei anabolice și controlul apetitului care este mediat de un intermediar în calea biosintezei acizilor grași. Este bine documentat (4) că sinteza acizilor grași în țesuturile lipogene, de exemplu, ficatul și țesutul adipos, are loc numai în timpul surplusului de energie și că excesul de combustibili fiziologici este canalizat în căile de stocare a energiei, în principal lipogeneza și glicogeneza. Dovezi recente (3, 5) sugerează că un intermediar de reglare cheie în calea biosintetică a acidului gras, și anume malonil-CoA, poate servi ca o legătură fiziologică/mediator între sinteza acizilor grași din hipotalamus și controlul aportului de alimente. Cerulenina și C75 sunt inhibitori puternici ai sintazei acizilor grași și s-a demonstrat că provoacă acumularea de malonil-CoA (substrat al enzimei) în ficat, un țesut mai accesibil decât hipotalamusul (3). Acum este ferm stabilit că în ficat și mușchi, malonil-CoA reglează oxidarea acizilor grași prin controlul intrării acizilor grași în matricea mitocondrială, locul β-oxidării (6, 7). Astfel, există un precedent pentru rolul malonil-CoA ca mediator al stării energetice (8, 9).

Dovezi circumstanțiale în creștere (3, 10, 11) susțin ipoteza că un nivel crescut de malonil-CoA în hipotalamus, cauzat de inhibarea acizilor grași sintaza, este responsabil pentru blocarea reglării în sus a NPY hipotalamică indusă de post. În plus față de efectele asupra expresiei NPY, am constatat recent (10) că efectul supresiv al C75 asupra consumului alimentar al șoarecilor slabi pare a fi mediat de schimbări reciproce în expresia NPY/AgRP și POMC/CART. În schimb, la șoarecii obezi (ob/ob), efectul pare a fi mediat doar de modificări ale expresiei NPY și AgRP. În concordanță cu aceste diferențe, am constatat că o singură injecție de C75 la șoareci slabi reduce inițial aportul de alimente și greutatea corporală, dar administrarea repetată pe parcursul mai multor zile provoacă toleranță. În schimb, șoarecii ob/ob sunt mai receptivi la C75 și prezintă o reducere continuă a aportului de alimente și a pierderii în greutate pe parcursul perioadei de studiu, toleranța incipientă devenind evidentă numai după o scădere substanțială a adipozității.

Proceduri experimentale

Hrănirea și manipularea șoarecilor.

Șoarecii C57BL/6J și C57BL/6J-Lep ob (ob/ob) de șase săptămâni de la Laboratorul Jackson au fost adăpostiți individual într-o lumină (12-h întuneric, 1800-0600 h/12-h ciclu de lumină, 0600- 1800 h) și cameră controlată de temperatură (22 ° C). Șoarecii au fost hrăniți cu o dietă de laborator (Prolab RMH 1000) din PMI Feeds (St. Louis). Pentru a prepara șoareci obezi indus de dietă (DIO), șoarecii C57BL6/J au fost hrăniți fie cu o dietă bogată în grăsimi (D12492), fie cu o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (D12450B) (Research Diets, New Brunswick, NJ) timp de 7 săptămâni. Dieta bogată în grăsimi conținea 60% din caloriile totale din grăsimi, în principal sub formă de untură, în timp ce dieta cu conținut scăzut de grăsimi conținea 10% din caloriile totale din grăsimi. Șoarecii au fost cântăriți de două ori pe săptămână. După 7 săptămâni, șoarecii din dieta cu conținut scăzut de grăsimi au avut o creștere a greutății corporale de 34 ± 4%, în timp ce cei din dieta cu conținut ridicat de grăsimi au avut o creștere a greutății corporale de> 70% și au fost definiți ca DIO.

După o perioadă de aclimatizare de 7 zile, șoarecii au fost randomizați la unul dintre cele trei grupuri de tratament: grupul 1, un grup de control injectat i.p. zilnic cu vehiculul timp de 5 zile; grupul 2, un grup tratat cu C75 care a fost injectat i.p. zilnic cu 10 mg/kg greutate corporală de C75 timp de 5 zile; și grupul 3, un grup hrănit în perechi care a fost hrănit cu aceeași cantitate de dietă ca cea consumată de animalele care au primit C75. Aportul alimentar și greutatea corporală au fost monitorizate de mai multe ori pe zi (vezi mai jos). Șoarecii au fost injectați cu C75 sau vehicul cu 3 ore înainte de aprinderea luminilor (1500 h). Consumul de alimente a fost măsurat la diferite intervale după injectare (interval 1, 1500–1800 h; interval 2, 1800–2100 h; interval 3, 2100–0900 h; interval 4, 0900–1500 h). În ziua 5 (sfârșitul perioadei de studiu), șoarecii au primit ultima injecție (cu C75 sau vehicul) cu 3 ore înainte de stingerea luminilor și au fost uciși la începutul ciclului de întuneric (la 1800 h). Hipotalamia (~ 20 mg fiecare) definită de marginea posterioară a chiasmei optice și marginea anterioară a corpurilor mamilare la o adâncime de ± 2 mm au fost disecate, congelate rapid în azot lichid și depozitate la -80 ° C.

Inhibitorul acidului gras sintază, C75 (greutate moleculară, 254,32), a fost sintetizat și dizolvat la comandă în mediul RPMI 1640 (GIBCO/BRL).

Pregătirea sondelor pentru testul de protecție RNase.

ADNc-uri parțiale care codifică fragmente de CART, NPY și POMC au fost obținute prin transcriptază inversă (RT) -PCR (folosind OneStep RT-PCR, Qiagen, Chatsworth, CA) din ADNc din prima catenă utilizând ARN total hipotalamic de șoarece așa cum este descris (10 ). Fiecare produs PCR a fost donat în vectorul pCRII-TOPO utilizând un promotor dublu kit de clonare TOPO TA (Invitrogen) și secvențiat. Un ADN plasmidic cu secvența corectă a fost preparat folosind setul maxi de plasmide Qiagen, purificat, liniarizat cu HindIII sau XbaI, extras cu fenol/cloroform și depozitat la -80 ° C. Plasmida albastră pT7 (Novagen) conținând o secvență parțială de ADNc AgRP de șoarece (396 bp, 1-396 din U89494, cadou de la Tina M. Hahn, Univ. California, Davis, CA) a fost liniarizată cu EcoRI, amplificată cu ARN polimerază T7 pentru a produce ARN antisens și utilizat pentru testul de protecție RNase.

Izolarea ARN-ului.

Țesutul hipotalamic înghețat (hipotalamice asociate din fiecare grup) a fost pulverizat cu un BioPulverizer II (Research Products International) răcit în azot lichid, iar ARN-ul total a fost extras din țesut folosind Isogen (Nippon Gene, Toyama, Japonia) conform procedurii producătorului . Concentrația de ARN a fost determinată din A260 nm și o analiză fluorometrică utilizând un kit de cuantificare ARN RiboGreen (Molecular Probes), ajustat la o concentrație constantă (aprox. 100 ng/μl) cu tampon 1 × TE fără RNază (10 mM TE/1 mM EDTA, pH 8,0) și depozitat la -80 ° C înainte de analiză.

Test de protecție RNase.

Analiza compoziției corpului.

Animalele au fost ucise, iar carcasele au fost depozitate la -80 ° C înainte de analiză. După îndepărtarea tractului gastro-intestinal, carcasa rămasă a fost uscată la o masă constantă la 60 ° C. Greutatea apei în carcasă a fost calculată ca diferență între greutățile umede și uscate. Masa de grăsime a fost determinată în carcasa uscată prin extracția lipidelor într-un aparat Soxhlet folosind eter de petrol (12). Masa uscată fără grăsime a fost considerată a fi masa rămasă după extracție. Masa fără grăsimi a fost calculată ca masa carcasei eviscerate minus masa grasă.

Analize statistice.

Toate datele sunt prezentate ca medii ± SE de determinări multiple. Datele au fost analizate prin ANOVA unidirecțional sau bidirecțional, cu sau fără măsuri repetate, după caz.

Rezultate

Studiile anterioare (3, 10) au arătat că administrarea unei singure doze mari (30 mg/kg greutate corporală) de șoareci slabi sau ob/ob rapid (în decurs de 1 oră) a blocat consumul de alimente și a cauzat o scădere dramatică a greutății corporale în următoarele 24 de ore. La niveluri mai mici de C75, răspunsul a fost dependent de doză și s-a inversat rapid la retragerea agentului (3). A fost de interes să se verifice dacă efectele C75 ar putea fi susținute cu administrarea repetată și dacă pierderea în greutate a șoarecilor tratați cu C75 se datorează în totalitate aportului redus de alimente/calorice.

Efectul administrării repetate de C75 la șoareci slabi.

Deoarece șoarecii slabi nu vor supraviețui restricției aproape complete a aportului alimentar timp de 4-5 zile cauzată de o doză mare de C75, s-au efectuat experimente preliminare pentru a determina nivelul de C75 necesar pentru a determina o scădere intermediară a aportului alimentar. Sa constatat că o doză de 10 mg C75/kg greutate corporală pe zi suprima consumul de alimente de șoareci slabi (C57BL/6J) cu 50-60% (rezultatele nu sunt prezentate); prin urmare, acest nivel de C75 a fost utilizat în experimentele ulterioare.

Compoziția corporală a șoarecilor ob/ob a fost analizată pentru a determina dacă pierderea în greutate cauzată de un tratament repetitiv cu C75 s-a datorat în primul rând pierderii de grăsime. Așa cum se arată în Tabelul 1, au existat diferențe semnificative în masa de grăsime corporală atât la șoareci tratați cu C75 (-4,5 g), cât și la șoareci ob/ob hrăniți în pereche (-3,8 g) în raport cu controalele tratate cu vehicul în cursul celor 5- perioada de tratament de o zi. Aceste diferențe în conținutul de grăsime corporală au reprezentat majoritatea diferențelor de greutate corporală dintre șoarecii tratați cu C75 și șoarecii hrăniți în perechi vs. șoareci de control. Tratamentul cu C75 a avut efecte mult mai mici asupra masei fără grăsimi și a conținutului de apă din corp.

Efectul C75 asupra compoziției corporale a șoarecilor ob/ob