Lisa Krugner-Higby

1 Centrul de resurse pentru animale de cercetare și

Stephen Caldwell

3 Universitatea din Virginia Departamentul de Medicină, Charlottesville, și

Kathryn Coyle

5 Biroul Provost, Universitatea din Kentucky, Lexington, Kentucky; și

Eugene Bush

6 Abbott Global Pharmaceutical Research, Abbott Park, Illinois

Richard Atkinson

4 Obetech, Richmond, Virginia;

Valerie Joers

2 Wisconsin National Primate Research Center, Universitatea din Wisconsin-Madison, Madison, Wisconsin;

Abstract

Materiale și metode

Animale.

dietei

Proiectare experimentală. Dieta 12%, dieta saraca in grasimi; Dieta 26%, dieta moderata cu grasimi; 45% dietă, dietă bogată în grăsimi.

Determinarea trigliceridelor serice.

Sângele a fost obținut prin cardiocenteză de la șoareci anesteziați cu pentobarbital, pus pe gheață și centrifugat pentru a colecta serul, care a fost apoi înghețat la -70 ° C până la testare. Probele pentru analiza trigliceridelor au fost obținute numai de la șoareci neînțepați. Un kit de testare comercială a fost utilizat pentru măsurarea trigliceridelor serice (catalog TR0100-1KT, Sigma Aldrich, St Louis, MO).

Măsurarea compoziției corpului.

Anestezia la șoarecii din California a fost indusă de izofluran gaz într-un recipient închis și menținută utilizând gaz izofluran furnizat de conul nasului. Șoarecii au fost așezați pe densitometru (Lunar PIXImus, GE Healthcare, Piscataway, NJ) pentru scanare (versiunea software 1.42.006.010, GE Healthcare). Scanările au durat aproximativ 15 min. Compoziția corpului a fost făcută utilizând un scaner de densitometrie care a fost validat pentru utilizare la șoareci de laborator. 25

Măsurarea terminală a compoziției corpului.

La necropsie, conținutul intestinal al carcaselor de șoarece a fost îndepărtat și apoi restul carcasei a fost înghețat la -20 ° C. Carcasele au fost autoclavizate la 250 ° C timp de 6 ore în pahare mari, acoperite. Materialul rezultat a fost omogenizat folosind un omogenizator cu foraj mare (PT 6000, Brinkman Instruments, Westbury, NY). Probele au fost cântărite înainte și după autoclavare. Grăsimea a fost extrasă în metanol: cloroform și apoi carcasele au fost uscate într-un cuptor sub vid la 60 ° C timp de 48 de ore. Probele triplicate au fost transformate în cenușă pentru determinarea conținutului de minerale. 4

Distribuția grăsimii corporale la șoarecii din California.

Șoarecii HR și LR au fost hrăniți fie cu dieta de 26%, fie cu cea de 12%, timp de 18 săptămâni. La necropsie, ficatul a fost punctat in situ pentru evidența grosieră a lipidozei hepatice, inclusiv extinderea ficatului dincolo de joncțiunea costocondrală, paloarea și modelul reticular. Scorul nu a fost efectuat orb la starea de tratament, dar scorurile brute au fost doar o măsură a steatozei hepatice utilizate în aceste studii. Ficatele au fost îndepărtate și cântărite la necropsie. Tampoanele de grăsime intraabdominale, gonadale, subscapulare și inghinale au fost îndepărtate și cântărite.

Histopatologie.

Șoarecii din California au fost eutanasiați utilizând pentobarbital (mai mare de 120 mg/kg IP). Probele de sânge au fost colectate terminal prin cardiocenteză, iar lobii hepatici drept și stâng au fost disecați liberi și fixați în formalină tamponată neutră 10% pentru evaluare histopatologică. Secțiunile fixate pe formalin au fost colorate cu hematoxilină și eozină și punctate utilizând un sistem de notare detaliat. 22 de secțiuni în serie au fost colorate cu tricrom Masson pentru a cuantifica mai bine depunerea de colagen asociată cu fibroza. Secțiunile hepatice reprezentative au fost colorate cu roșu ulei O pentru a vizualiza lipidele hepatice. Diapozitivele au fost codificate și punctate în conformitate cu criteriile standard 7.22 pentru steatoză, apoptoză, inflamație și fibroză de către un patolog veterinar îmbarcat (KC), care era orb la starea de tratament.

Concentrația de leptină în circulație.

Probele de sânge au fost obținute prin sângerare retroorbitală sau cardiocenteză de la șoareci sub anestezie pentobarbitală profundă în momentul necropsiei. Serul a fost separat de elementele celulare prin centrifugare. Serul a fost îndepărtat, plasat într-un tub proaspăt și congelat la -70 ° C până la testare. Concentrația serică de leptină a fost testată folosind kituri comerciale (Murine Leptin ELISA, Crystal Chem, Downers Grove, IL).

Rezultatele experimentelor inițiale de cuantificare și caracterizare a cantității și distribuției de grăsimi la șoarecii din California au indicat că fenotipul steatozei hepatice observat în experimentele anterioare ar putea deveni mai extrem și se poate manifesta mai rapid dacă dieta conține mai multe grăsimi. Experimentele folosind dieta de 45% s-au concentrat pe steatoza hepatică, deoarece grăsimea este depozitată în ficatul șoarecilor. Grupuri de șoareci HR și LR (n = 8) au fost hrăniți cu 45% dietă timp de 6 săptămâni. Șoarecii au fost eutanasiați, iar ficatul a fost colectat, cântărit și fixat în 10% formalină tamponată neutră. Secțiunile colorate cu hematoxilină și eozină au fost evaluate pentru steatoză și inflamație așa cum s-a descris anterior. 22 de grupuri suplimentare de 4 șoareci LR au fost hrăniți fie cu dieta de 12%, fie cu cea de 45%, timp de 6 săptămâni. Șoarecii au fost eutanasiați, iar probele de ficat au fost congelate la -80 ° C. Ficatele au fost extrase și testate pentru conținutul de lipide, proteine ​​și cenușă, așa cum este descris mai jos.

Analiza compoziției hepatice.

probe umede de ficat (1 g) au fost analizate pentru compoziții relative de lipide, proteine ​​și cenușă. Greutatea ficatului uscat a fost determinată prin liofilizarea probelor de ficat umed timp de 72 de ore. Porțiunile lipidice ale probelor de ficat uscate au fost separate de proteină și cenușă. 16 Fracțiile lipidice colectate au fost uscate sub centrifugare sub vid și cântărite pentru a determina greutatea lipidică a probelor de ficat uscate. Greutatea fracției de proteine ​​și cenușă a probelor de ficat uscat a fost determinată prin scăderea greutăților fracțiunii lipidice din greutățile totale ale ficatului uscat. Rezultatele au fost exprimate pe gram de ficat uscat.

Analiza datelor și statisticile.

ANOVA, testele Student t și analiza corelației au fost efectuate pe date parametrice utilizând software-ul Excel (Microsoft, Redmond, WA). Testele neparametrice, incluzând corelația ordinii rangului Spearman cu covarianța, testul Mann-Whitney și testul Kruskal-Wallis au fost efectuate utilizând software-ul SPSS (SPSS Institute, Cary, NC). Raporturile de cote au fost calculate utilizând Epi Info (Centers for Disease Control, Atlanta, GA). Semnificația a fost dedusă la un nivel α mai mic sau egal cu 0,05. Datele sunt date ca medie ± SE.

Rezultate

Analiza antemortem și postmortem a grăsimii corporale.

Scanările DEXA ale șoarecilor adulți din California au indicat că șoarecii hrăniți cu dieta moderată (26%) cu grăsimi dobândesc grăsimi corporale suplimentare pe măsură ce îmbătrânesc. Șoarecii din California scanați la vârsta de 1 an au avut semnificativ (P Figura 2 A), cu 3 săptămâni înainte ca șoarecii să fie eutanasiați pentru analiza terminală a grăsimii corporale. Un grup de control al șoarecilor californieni cu vârsta potrivită (cu vârsta mai mare de 1 an) care au alimentat o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (12%) au fost scanate în același timp. Șoarecii din California hrăniți cu dieta de 26% au avut semnificativ (P Figura 2 B). Nu au existat diferențe semnificative între șoareci de sex masculin și femele la fiecare moment (1 sau 1,5 ani) sau în funcție de dietă. La trei săptămâni după ultima scanare DEXA, ambele grupuri de dietă de 12% și 26% au fost eutanasiate. Evaluări terminale ale grăsimii corporale prin metanol: extracția cloroformului a validat rezultatele scanărilor DEXA, prin aceea că șoarecii hrăniți cu dieta de 12% au avut o semnificativă (P Figura 3). Similar cu rezultatele obținute prin utilizarea scanării DEXA, nu a existat nicio diferență semnificativă între șoarecii masculi și femele în ceea ce privește grăsimea corporală post-mortem. Analiza de corelație care compară rezultatele analizelor de grăsime corporală ante și postmortem a indicat o corelație mult mai mare între rezultatele analizei grăsimii corporale efectuate prin scanarea DEXA antemortem și analiza chimică a grăsimii corporale postmortem la șoarecii care au alimentat dieta de 12% (r = 0,76) decât pentru șoarecii hrăniți cu dieta de 26% (r = 0,57). Prin urmare, șoarecii hrăniți cu dieta de 26% păreau să aibă depozite de grăsimi care au fost slab evaluate prin scanare DEXA și care nu erau prezenți la șoarecii hrăniți cu dieta de 12%.

Rezultatele scanării DEXA pentru determinarea grăsimii corporale la șoareci adulți din California. *, P ≤ 0,05. (A) Procentul mediu de grăsime corporală (bară de eroare, 1 SD) într-o cohortă de șoareci din California (n = 11; mascul = 5, feminin = 6) care au alimentat dieta moderată (26%) cu grăsimi. Scanările au fost făcute la vârsta de 1 și 1,5 ani. (B) Procentul mediu de grăsime corporală (bară de eroare, 1 SD) la șoarecii din California hrăniți cu 26% (n = 11; mascul = 5, feminin = 6) sau 12% (cu conținut scăzut de grăsime; n = 12; mascul = 3, feminin = 9) dieta. Șoarecii au fost evaluați la aproximativ 1,5 ani.

Procentul mediu de grăsime corporală (bară de eroare, 1 SD) la șoareci din California hrăniți moderat (26%; n = 10; mascul = 4, feminin = 6) sau scăzut (12%; n = 10; mascul = 5, feminin = 5) dieta. *, P ≤ 0,05.

Distribuția grăsimii corporale la șoarecii din California.

Greutatea medie a tampoanelor de grăsime (bară de eroare, 1 SD) la șoarecii din California care au alimentat dieta moderată (26%) cu grăsimi. (A) Pisici mici (HR = 11, LR = 7). (B) Șoareci femele (HR = 6, LR = 9). *, P ≤ 0,05.

Greutatea ficatului și scorul ficatului gras.

Șoarecii HR hrăniți cu dieta de 26% au avut o creștere mai mare (P Figura 5). Când ficății au fost evaluați pentru dovezi de steatoză hepatică, șoarecii HR California hrăniți cu dieta de 26% aveau o probabilitate mai mare de a avea un ficat gras (gradul 1 sau mai mare; raportul de șanse = 11,0, P = 0,013) decât șoarecii LR hrăniți cu aceeași dietă . Șoarecii HR hrăniți cu dieta de 12% nu au avut un risc crescut de a avea un ficat gras în comparație cu șoarecii LR (P = 0,74). Concentrațiile serice de trigliceride la șoareci din California evaluate pentru steatoză hepatică la 24 săptămâni au urmat tendințele raportate anterior în ceea ce privește răspunsul dietetic și genetic 24, deși dieta a fost mai puternic asociată (P Figura 6 A), în timp ce altele, în special cele hrănite cu dieta de 26%, au avut acumulare de grăsime hepatică pronunțată (Figura 6 B și C). Atât steatoza macro, cât și microvesiculară a fost evidentă, dar a predominat microsteatoza, atât în ​​hepatocitele cu baloane, cât și în hepatocitele încărcate de lipide, cu arhitectură celulară normală (Figura 6 B). Fibroza, inflamația, corpurile Mallory și apoptoza au fost mai puțin frecvente. Această constatare a indicat faptul că starea la șoareci seamănă mai mult cu NAFLD uman decât cu NASH. 7,15,22 Fibroza, atunci când era prezentă, era de obicei lobulară și cu severitate ușoară până la moderată (datele nu sunt prezentate). Extinderea bolii hepatice grase la șoarecii din California a fost asociată cu hrănirea dietei de 26% (corelația Spearman rang-ordin, P Figura 7).

Scorurile de steatoză pentru șoarecii din California au hrănit dietele cu conținut scăzut, moderat sau bogat în grăsimi (12%, 26% și, respectiv, 45%). *, P ≤ 0,05 (test Mann - Whitney U).

Extracția chimică a ficatului.

Lipidele medii, proteinele și cenușa și greutățile totale (bară de eroare, 1 SD) de la ficatul șoarecilor din California hrăniți cu o dietă cu conținut scăzut de grăsimi (12%) sau bogat (45%). *, P ≤ 0,05.

Concentrația de leptină în circulație.

Concentrațiile circulante de leptină nu au diferit între șoarecii LR sau HR șoarecii hrăniți cu dieta de 12% sau 26% (Figura 9).

Concentrațiile medii de leptină serică (bară de eroare, 1 SD) la șoarecii din California hrăniți cu o dietă scăzută (12%) sau moderată (26%) cu grăsimi. Diferențele au fost nesemnificative.

Discuţie

Sindroamele care produc exces de lipide, obezitate și lipoatrofie pot să nu fie discrete, ci mai degrabă să existe ca un continuum. La un capăt al spectrului obezității sunt sindroame genetice care provoacă boli foarte severe, cum ar fi deficiențe în leptina funcțională, receptorul de leptină și calea melanocortinei. 29 La celălalt capăt al spectrului sunt sindroame genetice patologice și sindroame lipoatrofice dobândite. 18,32 Între aceste extreme există condiții în care un organism ar putea fi selectat în mod evolutiv pentru a manifesta aspecte ale obezității sau lipoatrofiei pentru a exploata un avantaj adaptativ. De exemplu, indienii Pima devin obezi și diabetici la o dietă tipică occidentală. Au fost identificate populații umane suplimentare care manifestă obezitate și diabet de tip II în condiții de surplus alimentar, dar care au suferit perioade lungi de foamete sau boli. 28,35

Ideea că diverse populații se pot adapta la perioadele de deficit caloric prin stocarea mai eficientă a caloriilor sub formă de grăsime este denumită „ipoteza de genotip economist”, idee care a fost recent criticată și discutată pe larg. 28.35 Selecția pentru lipoatrofie parțială nu a fost bine documentată la om, dar studii recente 13 din Bengalul de Vest au identificat persoane cu NAFL, dintre care 75% sunt neobezi. La această populație, persoanele al căror indice de masă corporală a fost cuprins între 25 și 30 și cei cu indice de masă corporală mai scăzut, dar fără obezitate viscerală, au avut o prevalență ridicată a NAFL. 13 Depozitarea grăsimilor hepatice fără obezitate face parte din biologia păsărilor. Rațele și gâștele acumulează grăsime în ficat, dar foarte puțină grăsime periferică, pentru a furniza energie pentru perioadele lungi de post în timpul migrației. Oamenii manipulează acest aspect al biologiei lor pentru producerea de foie gras. 17

Șoarecii din California nu sunt predispuși să depună grăsime periferică în condiții de exces caloric. Nu au obezitate viscerală remarcabilă, având în vedere că greutatea tamponului adipos abdominal nu diferă între șoarecii HR și LR sau între grupurile de dietă de 12% și 26% (Figura 4), dar depun grăsimi în ficat. Aceste rezultate sunt în concordanță cu un sindrom lipoatrofic parțial. Lipoatrofia parțială la șoarecii din California este probabil nepatogenă atunci când sursele alimentare bogate în calorii sunt sezoniere și limitate. Cu toate acestea, în laborator, nu există o perioadă compensatorie de deficit caloric pentru a epuiza depozitele de grăsime hepatică și șoarecii dezvoltând ulterior rezistență la insulină. În studiul actual, rezultatele din DEXA au arătat o corelație mai mare cu conținutul de grăsime corporală la șoarecii hrăniți cu dieta de 12% decât dieta de 26%. DEXA poate subestima conținutul de grăsime al organelor solide, cum ar fi ficatul, 12 explicând probabil această discrepanță.

Cele mai vechi modele de rozătoare ale NAFLD au implicat modificări determinate genetic în semnalizarea leptinei, rezultând ficatul gras în condițiile obezității. 2 Au apărut modele ulterioare bazate pe manipulări dietetice, cum ar fi utilizarea unei diete cu deficiență de metionină - colină, iar modele mai noi de rozătoare au fost create folosind tehnologia transgenică. Toate aceste modele pot oferi informații unice asupra fiziopatologiei, dar diferă de obicei fiziologic de NAFLD tipic uman. 15,25,26,29,33 Practic, toate aceste modele au una sau mai multe caracteristici ale NAFLD umană, dar inflamația și fibroza asociate în mod tradițional cu NASH au fost mai greu de reprodus într-un model animal fără a recurge la metode de inducere a inflamației sistemice, cum ar fi injecția de endotoxină, care nu sunt asociate cu patogeneza NASH umană. Cu toate acestea, unii anchetatori nu cred că fibroza este necesară pentru un diagnostic de NASH și, prin urmare, notează severitatea bolii pe baza steatozei, a inflamației și a degenerării cu baloane. 22 Steatoza indusă de dietă la șoarecii din California nu are ambele caracteristici definitive ale NASH (inflamație și fibroză), dar are atributele NAFLD. 1

Chiar dacă șoarecii din California au avut steatoză hepatică, modificarea inflamatorie a ficatului a fost minimă (Figura 6 B și C). În plus, enzimele hepatice, inclusiv AST și ALT, pot fi evaluate pentru a determina gradul de afectare a ficatului. Afectarea ficatului suficient de severă pentru a determina creșterea enzimelor hepatice este mai frecventă și mai severă la persoanele cu NASH, care au inflamație hepatică, decât la persoanele cu NAFLD. 6-10 șobolani hrăniți cu o dietă bogată în grăsimi mai extremă (71% energie din grăsimi) decât cele utilizate în studiul actual dezvoltă NAFLD, dar nu au concentrații crescute de AST sau ALT. 1 Singura patologie pe lângă inflamația hepatică minimă la șoarecii noștri din California a fost prezentă la șoarecii HR care au murit când au fost hrăniți cu dieta de 45%; la necropsie, acești șoareci au prezentat semne compatibile cu cetoacidoza. O mortalitate neașteptată similară a apărut atunci când acești șoareci au fost hrăniți cu dieta de 26% în timpul alăptării. 24 Factorii de risc care diferențiază NASH de NAFLD nu sunt cunoscuți, dar pot fi implicate surse extrahepatice de infecție focală sau inflamație. 3

Genele identificate în prezent care sunt asociate cu lipoatrofia parțială la ființele umane nu iau în considerare toate cazurile documentate ale bolii. În plus, pot exista populații umane care s-au adaptat pentru a avea o capacitate foarte limitată de a extinde masa de grăsime periferică și care nu au sindrom metabolic clinic semnificativ atunci când au o dietă de rezervă, dar care dezvoltă rezistență la insulină atunci când dieta este mai luxuriantă, în esență imagine oglindă a patogenezei obezității la indienii Pima. 35 Profilarea expresiei genei și a metabolismului în ficat și țesutul adipos poate identifica gene noi asociate cu patogeneza bolilor hepatice grase și a lipoatrofiei și, prin urmare, dezvăluie ținte noi pentru terapia acestor tulburări. Genele țintă putative pentru exprimarea profilării includ cele pentru citokine, receptorul LDL și proteinele care leagă acidul gras și genele lipogene, inclusiv proteina de legare a elementelor de reglare a sterolului și receptorul activat al proliferatorilor de peroxizomi γ.

Mulțumiri

Îi mulțumim pe Mary Tagliarino și personalul de îngrijire a animalelor de la Școala de Medicină Veterinară pentru îngrijirea șoarecilor, Allyson Holler pentru asistență tehnică și Shane Huebner și Dr. Mark Cook pentru analiza lipidelor. Acest studiu a fost susținut de RO3 AG18551 la LKH.