Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Contribuție: conceptualizare, analiză formală, achiziție de finanțare, metodologie, scriere - proiect original

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Corespondenţă

Jing Du, Laboratorul cheie Dalian de biologie a conservării pentru mamiferele marine pe cale de dispariție, Institutul de cercetare științifică a oceanului și pescuitului Liaoning, 50 Heishijiao Road, districtul Shahekou, Dalian, Liaoning, China.

Contribuție: Conceptualizare, conservarea datelor, achiziționarea de fonduri, investigație, metodologie, scriere - proiect original

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Contribuție: Analiză formală, Software, Scriere - revizuire și editare

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Contribuție: conceptualizare, resurse, supraveghere, scriere - revizuire și editare

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Contribuție: Investigație, Metodologie, Scriere - proiect original

Centrul de servicii de dezvoltare a producției agricole moderne Dalian, Dalian, China

Contribuție: Analiză formală, administrarea proiectului

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Contribuție: Analiză formală, administrarea proiectului

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Contribuție: conceptualizare, analiză formală, achiziție de finanțare, metodologie, scriere - proiect original

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Corespondenţă

Jing Du, Laboratorul cheie Dalian de biologie a conservării pentru mamiferele marine pe cale de dispariție, Institutul de cercetare științifică a oceanului și pescuitului Liaoning, 50 Heishijiao Road, districtul Shahekou, Dalian, Liaoning, China.

Contribuție: Conceptualizare, conservarea datelor, achiziționarea de fonduri, investigație, metodologie, scriere - proiect original

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Contribuție: Analiză formală, Software, Scriere - revizuire și editare

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Contribuție: Conceptualizare, Resurse, Supraveghere, Scriere - revizuire și editare

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Contribuție: Investigație, Metodologie, Scriere - proiect original

Centrul de servicii de dezvoltare a producției agricole moderne Dalian, Dalian, China

Contribuție: Analiză formală, administrarea proiectului

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Contribuție: Analiză formală, administrarea proiectului

Dalian Key Laboratory of Conservation Biology for Endangered Mamifere marine, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian, China

Abstract

Mamiferele marine reprezintă o parte importantă a ecosistemelor oceanice, dintre care balenele joacă un rol vital în lanțul alimentar marin. În acest studiu, mucoasa și conținutul din diferite segmente ale tractului intestinal (ITS) ale unei balene pitice eșuate (Balaenoptera acutorostrata) au fost analizate. Microbiota intestinală a fost secvențiată folosind tehnologie de secvențializare de mare viteză, bazată pe o abordare 16S rRNA. Compoziția microbiană a mucoasei intestinale și conținutul acesteia au fost similare în fiecare ITS. Bogăția și diversitatea microbiotei intestinului gros au fost semnificativ mai mari în comparație cu duodenul și jejunul. Bacteriile dominante din intestin au fost Firmicute și Actinobacterii; primul a fost îmbogățit în intestinul gros, în timp ce cel din urmă a fost mai abundent în duoden și jejun. Descoperirile noastre oferă informații noi pentru microbiota din B. acutorostrata.

1. INTRODUCERE

Tractele digestive animale sunt microecosisteme complexe compuse din celule gazdă și microbiote intestinale (Backhed, 2005). Relația lor simbiotică nu numai că influențează metabolismul gazdei, producția de energie, creșterea și imunitatea, ci stă la baza mai multor condiții patologice (Flint, Scott, Louis și Duncan, 2012; Malmuthuge, Li, Goonewardene, Oba și Guan, 2013). Mamiferele marine sunt rezervoare microbiene importante datorită temperaturii corporale constante și a dimensiunilor mari (Higgins, 2000), iar în ultimii ani s-a elucidat microbiota comensală a diferitelor mamifere marine (Chiarello, Villéger, Bouvier, Auguet și Bouvier, 2017; Numberger, Herlemann, Jürgens, Dehnhardt și Schulz-Vogt, 2016). Monitorizarea microbiotei intestinale a mamiferelor marine poate ajuta la dezlegarea mecanismelor de adaptare la diferite diete sau habitate. De exemplu, un studiu metagenomic a raportat un potențial ridicat de transport al nutrienților și ciclism în microbiota intestinală a leului de mare australian, Neophoca cinerea (Lavery, Roudnew, Seymour, Mitchell și Jeffries, 2012). Mai mult, microbiota intestinală a balenelor și a erbivorelor terestre prezintă un metabolism fermentativ similar, în timp ce căile de sinteză a proteinelor catabolice și a aminoacizilor din intestinul balenelor seamănă foarte mult cu carnivorele terestre (Sanders și colab., 2015).

Balena minke pitică, Balaenoptera acutorostrata, este cea mai abundentă specie de balenă balenă și este răspândită pe scară largă în regiunile Atlanticului de Nord și Pacificului de Nord (Walquist, Stormo, Jensen, Bjarne și Eilertsen, 2017). Se hrănește pești precum capelin, hering, macrou și cod, precum și crustacee, cum ar fi krill (Jonsgård, 1982; Windsland, Lindstrom, Nilssen și Haug, 2007), sugerând că microbiota intestinală a balenei este adaptabilă la diverse alimente surse. Datorită dimensiunii sale, B. acutorostrata are un tract digestiv lung, sugerând o compoziție variată de microbiote intestinale din diferite segmente ale tractului intestinal (ITS). Cu toate acestea, aceste compoziții sunt în prezent necunoscute. Prin urmare, comparațiile microbiotei intestinale între diferite ITS ale B. acutorostrat ar putea oferi perspective noi asupra digestiei și metabolismului alimentelor.

Un proaspăt mort B. acutorostrata a fost găsit pe o plajă din Dalian, China, iar mucoasa intestinală și conținutul acestuia au fost ulterior obținute. Am analizat microbiota din diferite ITS folosind tehnologia de secvențiere de mare viteză bazată pe analiza genei 16S rRNA. Din câte știm, acesta este primul studiu care analizează microbiota diferitelor ITS din B. acutorostrata.

2. MATERIALE ȘI METODE

2.1 Colectarea probelor

microbiotei

2.2 Extracția ADN-ului

ADN-ul genomic bacterian a fost extras din 30 de probe folosind kitul de ADN pentru scaun TIANamp (Tiangen, China) conform instrucțiunilor producătorului. ADN-ul a fost verificat prin electroforeză pe 1,5% geluri de agaroză. Concentrația și puritatea ADN-ului au fost măsurate pe fluorometrul Qubit ™ 4 (Invitrogen, SUA) și depozitate la -20 ° C până când este necesar.

2.3 Amplificarea și secvențierea genei ARNr 16S

Regiunile V3 - V4 ale ARNr 16S au fost amplificate folosind primerii 341F (5 ′ - CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT - 3 ′) și 806R (5 ’- GGACTACNVGGTWTCTAATCC - 3 ′). Toate reacțiile PCR au fost efectuate într-un amestec master 25 masterl, constând din 2,5 µl TransStart Buffer, 2 µl dNTPs (2,5 mM), 0,5 µl ADN polimerază TranstartTaq (TransGene, China), câte 1 µl fiecare din primeri înainte și invers (100 µM), și șablon ADN de 20 ng. Parametrii ciclului au inclus o denaturare inițială la 94 ° C timp de 3 secunde, urmată de 24 de cicluri de denaturare la 94 ° C timp de 5 secunde, recoacere la 57 ° C timp de 90 secunde și alungire la 72 ° C timp de 10 secunde. Produsele PCR au fost purificate și cuantificate și au fost generate biblioteci de ampliconi. Bibliotecile au fost secvențiate pe o platformă Illumina Miseq folosind o strategie de pereche de 250 perechi de baze (bp).

2.4 Prelucrarea secvențierii datelor

Toate secvențele citite au fost analizate prin Bcl2fastq v 2.17.1.14. Citirile de calitate mai scăzută au fost eliminate, pe baza scorurilor Phred medii 8, nepotrivirile primerului și lungimile secvenței de 20 bp suprapuse și fără nepotriviri au fost asamblate în etichete folosind FLASH (Magoc și Salzberg, 2011). Aceste etichete au fost adnotate la eșantioane pe baza codurilor lor de bare unice, iar apoi, codurile de bare și secvențele de grund au fost eliminate. Secvențele chimerice au fost recunoscute și eliminate de pachetul software QIIME (Caporaso și colab., 2010), iar etichetele cu similaritate ≥97% au fost atribuite aceleiași unități operaționale taxonomice (OTU) folosind VSEARCH v 1.9.6 (Edgar, 2010). Secvențele reprezentative ale fiecărei OTU au fost alese aleatoriu și li s-a atribuit taxonomie utilizând clasificatorul de proiecte Ribosomal Database (Wang, Garrity, Tiedje și Cole, 2007) pe baza bazei de date SILVA (Yilmaz și colab., 2014). În cele din urmă, abundențele relative ale diferitelor OTU-uri au fost calculate și normalizate la eșantion, cu cel mai mic număr de etichete (Tabelul S1).

2.5 Analiza statistică

Au fost calculați indicii Chao1 și Shannon reprezentând diversități alfa, iar curbele de rarefacție au fost create folosind QIIME (Kemp & Aller, 2004). Indicii din diferite ITS au fost comparați utilizând testele HSD ale lui Tukey. Metoda perechi-grup neponderată, cu grupări medii aritmetice (UPGMA), a fost utilizată pentru a analiza asemănările compoziției microbiene între diferitele STI. Abundența speciilor la nivelul filului a fost vizualizată folosind software-ul Circos (Krzywinski și colab., 2009).

3. REZULTATE SI DISCUTII

3.1 Bună diversitate a microbiotei

Am secvențiat 30 de eșantioane din diferite ITS din B. acutorostrata și a generat în medie 70.288 de etichete pe eșantion. Curbele de rarefacție pentru fiecare probă au fost apropiate de o linie dreaptă (Figura 2a), indicând faptul că datele de secvențiere au reprezentat întreaga comunitate microbiană. Aceste etichete au fost grupate în 172 OTU la nivelul de similaritate de 97% și fiecare OTU a fost adnotată de la filum la nivelul speciilor.

Am folosit indici de diversitate alfa pentru a analiza microbiota intestinală a diferitelor ITS. Indicele Chao1 a fost utilizat pentru a evalua bogăția speciilor, adică numărul de specii din comunitățile microbiene (Colwell & Levin, 2009). Așa cum se arată (Figura 2b), bogăția microbiană a mucoasei intestinale și a conținutului din aceleași ITS au fost similare, cu excepția duodenului. Bogăția microbiotei intestinale a variat între 70 și 130, ceea ce a fost similar (Chao1 = 84) cu comunitățile microbiene din fecalele de balenă beluga (Sanders și colab., 2015). În schimb, bogăția microbiotei intestinale provenite de la cetacee mai mici, cum ar fi delfinii muncitori (Chao1 = 41) și marsopii fără aripi Yangtze (Chao1 = 30), au fost mai mici (McLaughlin, Chen, Zheng, Zhao și Wang, 2012). Mai mult, au fost detectate> 500 OTU în microbiomii intestinali de la balene cu cocoașă și cu balene drept (Sanders și colab., 2015), care sunt mai mari decât B. acutorostrata. Prin urmare, bogăția microbiotei intestinale cetacee poate fi proporțională cu mărimea corpului, deși sunt necesare mai multe dovezi pentru a valida această observație.

Indicele Shannon estimează diversitatea comunității microbiene în ceea ce privește bogăția și uniformitatea speciilor (Moreno și Rodríguez, 2010). Spre deosebire de indicele Chao1, diversitatea microbiană a mucoasei și conținutului cecal și rectal au fost semnificativ diferite în fiecare segment (Figura 2c, p 2008). Mai mult, tehnologia de amprentă moleculară a arătat că diversitatea bacteriană a colonului și rectului canin a fost semnificativ mai mare decât duodenul și jejunul (Suchodolski, Ruaux, Steiner, Fetz și Williams, 2005). Mai mult, comunitățile bacteriene din intestinul mediu și posteriorul castraveților de mare au avut o bogăție și o diversitate semnificativ mai mari în comparație cu foregut (Wang și colab., 2018). Luat împreună, compartimentul posterior al tractului intestinal ar putea fi mai potrivit pentru colonizarea microbiană între diverse specii de animale.

3.2 Compoziție bună a microbiotei

Balaenoptera acutorostrata divergența microbiotei intestinale a fost demonstrată prin analiza de grupare UPGMA, bazată pe distanțele Bray - Curtis (Figura 3). Microbiota mucoasei și conținutul aceluiași STI au fost grupate împreună, indicând faptul că bacteriile atașate și libere din întreaga B. acutorostrata intestinele erau consistente. Mai mult, probele din cecum, colon și rect au format un grup, iar microdota duodenului și jejunului au fost grupate, distincte de intestinul gros. Astfel, a apărut că compoziția microbiomului intestinal în B. acutorostrata a fost semnificativ dependentă de localizarea anatomică.

4. CONCLUZII

În acest studiu, compoziția microbiană intestinală a diferitelor ITS dintr-o balenă minke a fost secvențiată și comparată. S-au observat diferențe semnificative în compoziția microbiotei intestinale în diferite ITS; microbiomii compartimentelor posterioare au fost mai diversi decât foregut. Duodenul și jejunul au fost îmbogățite pentru Erisipelotrichales, Selenomonadale, și Coriobacteriales, întrucât Clostridiales erau mai abundente în intestinul gros.

MULȚUMIRI

Această cercetare a fost finanțată de Fundația Departamentului Oceanului și Pescuitului din provincia Liaoning, China, numărul grantului 201812 și 201822. Autorii recunosc contribuția dlui. Zelong Zhao de la Universitatea de Tehnologie Dalian pentru asistența sa tehnică cu informații despre funcția microbiotei intestinale a animalelor.

CONFLICTUL DE INTERES

CONTRIBUȚIA AUTORULUI

Jiashen Tian: Conceptualizare (egală); Analiza formală (egală); Achiziționarea de fonduri (egală); Metodologie (egală); Scriere - schiță originală (egală). Jing Du: Conceptualizare (egală); Curarea datelor (egală); Achiziționarea de fonduri (egală); Investigație (egală); Metodologie (egală); Scriere - schiță originală (egală). Zhichuang Lu: Analiza formală (egală); Software (egal); Scriere - recenzie și editare (egal). Jiabo Han: Conceptualizare (egală); Resurse (egale); Supraveghere (egală); Scriere - recenzie și editare (egal). Zhen Wang: Investigație (egală); Metodologie (egală); Scriere - schiță originală (egală). Duohui Li: Analiza formală (egală); Administrarea proiectului (egal). Xiaoyan Guan: Analiza formală (egală); Administrarea proiectului (egal). Zhaohui Wang: Investigație (egală).

DECLARAȚIE DE ETICĂ

Identificarea și disecția speciilor au fost aprobate de Ministerul Agriculturii și Afacerilor Rurale din Republica Populară Chineză (numărul permisului: 1376). Acest studiu a fost realizat în baza unui permis eliberat de Biroul de administrare a pescuitului Liaoning, provincia Liaoning, China (număr de aprobare: LSYXFZ20111105).

Cercetare deschisă

Citirile secvenței brute au fost încărcate în Arhiva de citire a secvenței Centrului Național pentru Informații despre Biotehnologie sub numărul de acces PRJNA600130: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA600130

Descrierea numelui de fișier
mbo31108-sup-0001-TableS1.docx Document Word, 29,9 KB Tabelul S1

Vă rugăm să rețineți: editorul nu este responsabil pentru conținutul sau funcționalitatea oricăror informații de susținere furnizate de autori. Orice întrebări (altele decât conținutul lipsă) ar trebui să fie adresate autorului corespunzător pentru articol.