• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: [email protected]

ABSTRACT

fundal Creșteri acute ale corticosteronului endogen (CORT) cu stres psihosocial sau administrare exogenă potentează expresia genelor inflamatorii. Obezitatea maternă ca urmare a consumului de diete bogate în grăsimi (HFD) a fost legată de niveluri bazale mai ridicate de neuroinflamare, incluzând expresia crescută a genelor pro-inflamatorii în amigdală. Aceste descoperiri sugerează că expunerea la HFD maternă poate provoca răspunsuri pro-inflamatorii în prezența unui factor de stres imun, cum ar fi lipopolizaharida (LPS), o componentă a bacteriilor gram-negative, precum și CORT crescut acut.

grăsimi

Metode Descendenții șobolanilor au fost expuși la HFD maternă sau la dieta de control (CHD) pe parcursul dezvoltării pre și postnatale până la înțărcare, când tuturor descendenților li s-a furnizat CHD până la vârsta adultă. La vârsta adultă, descendenții au fost „provocați” cu administrarea de CORT exogen, pentru a simula un stres fiziologic acut, LPS, pentru a induce un stres imunitar sau ambele. qPCR a fost utilizat pentru a măsura abundența transcriptă a receptorilor CORT și a genelor inflamatorii din aval în amigdala, hipocampul și cortexul prefrontal, regiunile creierului care mediază răspunsurile neuroendocrine și comportamentale la stres.

Rezultate Descendenții femele HFD au prezentat creșteri ale transcrierilor antiinflamatorii, în timp ce descendenții masculi HFD au răspuns cu o expresie genică proinflamatorie mai mare la administrarea simultană de CORT și LPS.

Concluzii Aceste descoperiri sugerează că expunerea la HFD maternă duce la modificări specifice sexului care pot modifica răspunsurile inflamatorii din creier, posibil ca răspuns adaptiv la inflamația bazală.

INTRODUCERE

Mai multe studii au legat expunerea la dezvoltare de niveluri ridicate de grăsimi saturate prin dieta maternă cu semnalizarea modificată a glucocorticoizilor și activitatea axei HPA la descendenții adulți. Nivelurile ridicate de grăsimi saturate în dietele obezogene materne induc inflamații și stres la mamă, care ajunge la descendenți în curs de dezvoltare atât în ​​uter, cât și în timpul alăptării prin lapte (10,11). La om, dietele materne bogate în grăsimi (HFD) sunt legate de tulburări metabolice, precum și de tulburări de anxietate la copii (12-18). La descendenții rozătoarelor născuți din baraje obeze hrănite cu HFD, există o expresie modificată a GR și a genelor inflamatorii din aval în regiunile creierului care reglează axa HPA (19-25). De exemplu, laboratorul nostru a constatat creșteri ale expresiei genei pro-inflamatorii a NFκB și IL6 în amigdala în condiții bazale, împreună cu CORT seric reglementat în jos (19).

În studiul actual, am prezis că stresul imun în combinație cu administrarea CORT ar duce la o potențare mai mare a efectelor pro-inflamatorii la descendenții adulți expuși la HFD maternă, comparativ cu descendenții CHD. Pentru a investiga acest lucru, șobolanilor de sex feminin și masculi expuși la controlul matern sau HFD în timpul perioadei perinatale li s-a administrat CORT exogen pentru a simula stresul psihologic, LPS pentru a induce stres imunitar sau provocarea simultană CORT și LPS la maturitate. Abundența transcriptă a receptorilor CORT, inclusiv a genelor GR și a căilor inflamatorii în aval, a fost măsurată în amigdala, HPC și PFC. Descendenții de sex feminin și masculin au fost examinați separat, datorită diferențelor sexuale importante în greutatea corporală, răspunsurile endocrine și comportamentale la expunerile materne la HFD, CORT și LPS raportate anterior (19,22,26-28).

MATERIALE ȘI METODE

Îngrijire animale

Toate protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul local de îngrijire a animalelor de la Universitatea din Toronto Scarborough și au fost în conformitate cu liniile directoare ale Consiliului canadian pentru îngrijirea animalelor. Descendenții de șobolani adulți utilizați pentru acest studiu au fost colegi de litiere netestați din aceeași cohortă de animale în studiile anterioare publicate de grupul nostru (19,20). Pentru reproducere, șobolanii Long Evans adulți, de sex masculin și femel, de 7 săptămâni au fost achiziționați de la Charles River Canada (St. Constant, QC) și adăpostiți cu perechi de același sex și menținuți pe un ciclu de lumină-întuneric 12:12 h ( luminile aprinse de la 7:00 la 19:00) cu acces ad libitum la alimente și apă. Crescătoarele de sex feminin au fost plasate fie pe o dietă bogată în grăsimi (HFD, 5,24 kcal/g, n = 15) constând din 60% grăsimi, 20% proteine, 20% carbohidrați (D12492; Research Diets, Inc. New Brunswick, NJ.), sau o dietă de control casă (CHD, 3,02 kcal/g, n = 14) constând din 13,5% grăsimi, 28,5% proteine ​​și 58% carbohidrați (5001; Purine Lab Diets. St. Louis, MO) cu patru săptămâni înainte de împerechere, pe tot parcursul gestației, alăptării și până la înțărcare. Litters au fost cântărite săptămânal în timpul schimbărilor în cușcă și au fost altfel lăsate netulburate până la înțărcare (ziua post-natală (PND) 21), când au fost plasate toate pe o dietă CHD și adăpostite în perechi de același sex. La vârsta adultă (PND90), greutățile corporale au fost măsurate înainte de injecțiile CORT și LPS (Figura 1).

Femelele de reproducere adulte au fost plasate fie pe CHD (dietă de control casă), fie pe HFD (dietă bogată în grăsimi) cu patru săptămâni înainte de împerechere și au continuat prin gestație și lactație. Descendenții au fost înțărcați în CHD în ziua postnatală (PND) 21. În ziua post-natală (PND) 90, descendenții au fost injectați cu corticosteron (CORT), lipopolizaharidă (LPS) sau combinație CORT + LPS și au fost sacrificați 3 ore mai târziu.

Provocare pentru adult CORT și LPS

CORT dizolvat în propilen glicol (27840; Sigma-Aldrich) și LPS din Escherichia coli O111: B4, (L2630; Sigma-Aldrich) au fost utilizate pentru injecții subcutanate și, respectiv, intraperitoneale. Femelele și femelele adulte au fost manipulate 2 minute/zi timp de cinci zile consecutive începând cu PND85. La PND90, animalele au fost împărțite în unul din cele patru grupuri experimentale; 1) doză subcutanată de CORT (10 mg/kg de greutate corporală), 2) o doză intraperitoneală de LPS (50 μg/kg de greutate corporală), 3) o doză simultană de CORT și LPS (10 mg/kg, 50 μg/kg) sau 4) controale manipulate (n = 6 pe dietă, sex și tratament) (29). S-a arătat anterior că o doză de 10 mg/kg de CORT duce la un comportament crescut asemănător anxietății și la niveluri de CORT plasmatice circulante similare cu cele de câteva ore de stres fiziologic acut (30). S-a demonstrat că doza de 50 μg/kg de LPS activează axa HPA în decurs de 0,5-4 ore, după cum se arată prin creșterea nivelului CORT în sângele integral (31) și induce expresia citokinelor pro-inflamatorii în hipocampusul descendenților expuși la HFD matern. (22). Animalele au fost sacrificate la 3 ore după injectare prin inhalare de CO2 urmată de decapitare rapidă la mijlocul fazei luminoase (11-3 pm) pentru a controla schimbările legate de circadian în expresia genelor. Creierele au fost disecate, congelate rapid în izopentan și gheață uscată și depozitate la -80 ° C.

Extracția ARN și sinteza ADNc

Amigdala întreagă, hipocampul dorsal și cortexul prefrontal medial au fost crio-secționate folosind un criostat Leica CM3050 și coordonate stereotaxice (32). ARN a fost extras din amigdala, hipocampul dorsal și cortexul prefrontal medial folosind reactiv TRIzol (15596026; Invitrogen) în combinație cu RNeasy Plus Mini Kit (74134; Qiagen) conform instrucțiunilor producătorului. Cuantificarea ARN și evaluările calității s-au făcut folosind un spectrofotometru nanodrop (ND-2000C; Thermo Scientific). 1 μg de ARN total a fost convertit în ADNc folosind trusa de transcripție inversă ADNc de mare capacitate (4368814; Applied Biosystems) conform instrucțiunilor producătorului.

Analiza expresiei genei prin qPCR

Expresia relativă a ARNm a receptorului glucocorticoid (GR), receptorul mineralocorticoid (MR), factorul nuclear kappa amplificator al lanțului ușor al celulelor B activate (NFκB), factorul nuclear al amplificatorului genei polipeptide ușoare kappa în inhibitorul celulelor B, alfa (IκBα), interleukină 6 (IL6), interleukina 10 (IL10), grupul de molecule de diferențiere 11B (CD11B), proteina kinază fosfatază 1 activată cu mitogen (MKP1) și factorul de creștere insulinic 1 (IGF1) în cele trei regiuni ale creierului au fost măsurate folosind un StepOne Plus termociclator în timp real cu un mix master master SYBR Green PCR (4385612; Applied Biosystems). Grundurile au fost achiziționate de la Qiagen sau Eurofins Genomics și proiectate în conformitate cu informațiile secvenței GenBank de la Centrul Național pentru Informații despre Biotehnologie (NCBI) (Tabelul 1).

Expresia genetică relativă a fost calculată utilizând media medie pe baza unei curbe standard de 11 diluții seriale variind de la 500 ng/μL la 0,49 ng/μL de ADNc. S-a rulat o curbă standard pe placă și pe set de comparații. Mediile cantitative au fost normalizate față de GEOmean a patru gene de referință, YWAZ, GAPDH, 18 și Actin B. Genele de referință au fost identificate ca controale interne stabile pe baza analizei geNORM a stabilității în grupurile experimentale, regiunile creierului și sexul (33). Valorile M de stabilitate calculate de geNORM: YWAZ = 0,322, Actina B = 0,49, GAPDH = 0,49, 18S = 0,68. Nivelurile relative ale transcrierii au fost exprimate ca media ± SEM reprezentând n = 6 replici biologice per condiție experimentală.

Analize statistice

CORT se difuzează în citosol și se leagă de receptorul glucocorticoid (GR). Complexul CORT-GR induce expresia moleculelor antiinflamatorii, inclusiv IGF1, MKP1 și IKBα, care la niveluri bazale inhibă expresia pro-inflamatorie a NFκB, IL6 și CD11B indusă de semnalizarea LPS către receptorul de tip toll-like 4 (TLR4) și proteinele activate cu mitogen (MAP) kinaze. Cu toate acestea, cu niveluri mai ridicate de CORT, efectele antiinflamatorii sunt reduse. Acest sistem a fost modificat la femeile expuse la o dietă maternă bogată în grăsimi (HFD), după cum se indică prin creșterea MKP1 și un raport IL6/IL10 redus. Bărbații expuși la HFD maternă au prezentat transcriere NFκB crescută.

Răspunsuri antiinflamatorii îmbunătățite la provocarea CORT la descendenții masculi HFD

CORT este asociat în mod clasic cu efecte antiinflamatorii și imunosupresoare. Acțiunile antiinflamatorii ale CORT includ expresia crescută a IGF-1, IκBα și MKP1, care suprimă expresia mediatorilor inflamatori (34,35). În acest studiu, atât grupurile de dietă, cât și sexul au arătat o expresie crescută a IκBα în hipocampus ca răspuns la provocarea CORT (Figurile 3-4). Cu toate acestea, la bărbați, creșterea IκBα în hipocampus ca răspuns la CORT a fost mai mare în rândul descendenților HFD în comparație cu descendenții CHD. În general, bărbații HFD au prezentat, de asemenea, transcriere MR redusă în hipocampus. Este posibil ca transcrierea MR redusă să fi potențat și antiinflamarea indusă de GR cu administrarea CORT, deoarece disponibilitatea redusă a MR și saturația receptorilor cu CORT este asociată cu expresia crescută a GR (35-37). Acest lucru ar sugera că descendenții masculi expuși la HFD maternă pot tolera mai eficient factorii de stres psihologic sau endocrin acut decât descendenții CHD la vârsta adultă, inițind o semnalizare antiinflamatoare de protecție în hipocamp.

Răspuns pro-inflamator îmbunătățit la provocarea LPS la descendenții HFD de sex feminin

Modificări specifice sexului provocării CORT + LPS la descendenții HFD

CONCLUZIE

În acest studiu, am constatat că expunerea maternă la HFD a modificat răspunsurile transcriptului la descendenții adulți, prin provocare îmbunătățită anti-inflamație post-CORT la bărbați și pro-inflamație îmbunătățită post-LPS la femei. De asemenea, am găsit dovezi ale unei provocări sporite pro-inflamatorii post-CORT + LPS la bărbați, femeile prezentând antiinflamare îmbunătățită. Descoperirile noastre sugerează că expunerea la HFD maternă în timpul vieții timpurii induce răspunsuri transcripționale specifice sexului la stres la vârsta adultă. În prezent nu se știe dacă oamenii expuși obezității materne și dietelor bogate în grăsimi pot prezenta răspunsuri similare la stresul glucocorticoid și imunitar. Cu toate acestea, studii anterioare la rozătoare și la oameni au indicat faptul că obezitatea duce la inflamații prelungite și susceptibilitate crescută la infecție, sugerând că aceste efecte ar trebui examinate și în contextul oamenilor expuși la obezitate în timpul dezvoltării (51-53).

DISPONIBILITATEA DATELOR ȘI A MATERIALELOR

Datele utilizate în acest studiu sunt disponibile de la autorul corespunzător, la cerere.

FINANȚAREA

Această lucrare a fost susținută de un grant Discovery de la Consiliul de Științe Naturale și Inginerie din Canada (NSERC) către Dr. Patrick O. McGowan. Dr. Sanoji Wijenayake deține o bursă de cercetare postdoctorală NSERC.

CONTRIBUȚIILE AUTORILOR

AS și POM au proiectat experimentul. AS, POM și WCDV au efectuat lucrările la animale. CMWL, WCDV și MFR au efectuat lucrările moleculare. SW și MFR au analizat datele. MFR, SW și POM au interpretat datele și au scris manuscrisul. Toți autorii au citit și au aprobat manuscrisul final.

DECLARAȚIE ETICĂ

Aprobarea eticii și consimțământul de participare

Toate studiile pe animale s-au conformat cu Consiliul canadian privind orientările și politicile de îngrijire a animalelor și au fost aprobate de Comitetul local de îngrijire a animalelor de la Universitatea din Toronto Scarborough.

Consimțământul pentru publicare

Interese concurente

Autorii declară că nu au interese concurente.

MULȚUMIRI

Mulțumim Dr. Sameera Abuaish și Shathveekan Sivanathan pentru ajutor în munca moleculară și animală, iar Dr. Sohee Kang, profesor asociat și coordonator statistică la Universitatea din Toronto Scarborough, pentru furnizarea de consiliere și îndrumare statistică.