1 Institutul Bartholin, Rigshospitalet, 2200 Copenhaga, Danemarca

fără

2 Laboratorul de imunitate celulară specifică, Institutul de microbiologie ASCR, 54922 Praga, Republica Cehă

Abstract

Studiile au documentat că patogeneza diabetului autoimun este influențată de aportul de gluten. Obiective. Pentru a investiga importanța expunerii la gluten în timpul sarcinii și dezvoltarea ulterioară a diabetului autoimun la descendenți. Metode. Șoarecii diabetici neobezi au fost împărțiți în 7 grupuri pentru a primi combinații de dietă fără gluten și dietă standard înainte, în timpul sau după sarcină. Incidența diabetului la descendenți a fost urmărită în fiecare grup (

) timp de 310 zile. Scorul de insulită și expresia intestinală a factorilor de transcripție a celulelor T (RT-QPCR) au fost evaluați la animale din diferitele grupuri de dietă. Rezultate. Dacă mamele au fost hrănite cu o dietă fără gluten numai în timpul sarcinii, dezvoltarea diabetului autoimun la descendenți a fost aproape complet prevenită, cu o reducere a incidenței de la 62,5% la șoarecii consumatori de gluten la 8,3% (

) în grupul fără gluten. Insulele Langerhans au fost mai puțin infiltrate () și expresia intestinală a RORγt (Th17) () redus la șoarecii ale căror mame erau lipsite de gluten în timpul sarcinii. Concluzie. O dietă fără gluten exclusiv în timpul sarcinii previne în mod eficient dezvoltarea autoimună a diabetului la descendenți și reduce insulita și expresia intestinală a RORγt (Th17).

1. Introducere

Expunerea la gluten este un factor important în dezvoltarea diabetului de tip 1 (T1D) [1]. Atât la șoarecii diabetici neobezi (NOD), cât și la șobolanii Biobreeding (BB-), o dietă fără gluten (GF) [2, 3] sau hidrolizată [4] scade semnificativ incidența bolii. La om, o dietă cu conținut scăzut de carbohidrați GF a fost raportată recent pentru a induce remisia unui pacient T1D nou diagnosticat [5], iar secreția de insulină îmbunătățită a fost observată după 6 luni de dietă GF [6]. Apariția autoimunității celulelor beta poate fi legată de vârstă la introducerea cerealelor în dieta sugarilor [7, 8]. Mai mult, un conținut dietetic ridicat de monozaharide crește riscul de a dezvolta T1D [9, 10].

Nu se cunoaște mecanismul prin care gliadina influențează dezvoltarea bolii. Este probabil că imunitatea intestinală este implicată, deoarece noi [11] și alții [12, 13] am raportat că aportul de gluten conferă un profil de citokine proinflamatorii în mai multe populații de celule T reglatoare, inclusiv γδ Celulele T, în țesuturile limfoide mucoase. Este probabil ca aceste modificări să fie facilitate sau chiar dependente de faptul că peptidele glutenice pot transfera epiteliul, lucru pe care l-am demonstrat recent la șoarecii NOD și BALB/c (nepublicat) și care a fost raportat anterior la pacienții cu T1D [14].

De asemenea, este posibil ca un efect direct al peptidelor de gluten asupra celulelor beta să influențeze dezvoltarea bolii. Am arătat că o peptidă gliadină 33-mer poate închide direct canalul K și induce secreția de insulină [15]. Deși nu este clar în prezent dacă gliadina interacționează direct cu canalul K sau dacă semnalul este transmis prin alți receptori, cum ar fi TLR4, această activare celulară ar putea crește riscul dezvoltării bolii prin stresul celulelor beta [16].

Experimentele anterioare cu dieta GF la modele animale de diabet autoimun [2, 3, 17] au fost efectuate la animale expuse la dieta GF atât în ​​timpul sarcinii, cât și în perioada neonatală. Cu toate acestea, potențialul glutenului de a afecta procesul diabetogen pare să fie dependent de momentul introducerii glutenului, atât la animale [12, 13], cât și la oameni [7, 8]. Prin urmare, nu se știe dacă există o perioadă critică, în care efectul unei diete GF este cel mai eficient sau dacă ambele intervale de timp sunt la fel de importante. Acest lucru a fost investigat în acest studiu, care a arătat că dieta GF, exclusiv în timpul sarcinii, depășește cu mult eficiența altor perioade de tratament.

2. Metode

2.1. Animale


Șoarecii au fost păstrați într-o instalație specifică pentru animale fără patogeni (SPF)

grade, ciclu de lumină de 12 h, schimbarea aerului de 16 ori pe oră și umiditate

%) cu acces gratuit la apă și alimente. Cuștile aveau materiale de cuibărit și un adăpost din carton. Experimentele pe animale au fost efectuate cu aprobarea The Animal Experiments Inspectorate (2012-15-2934-00086), iar experimentele au fost reglementate de Directiva 2010/63/UE privind protecția animalelor utilizate în scopuri științifice.

2.2. Dietele

Animalele au primit fie STD, dieta Altromin nepurificată, fie o dietă GF, modificată Altromin (Altromin, Lage, Germania). Ambele diete experimentale au fost adecvate din punct de vedere nutrițional, cu un nivel similar de proteine, aminoacizi, minerale, vitamine și oligoelemente și doar sursa de proteine ​​diferă între diete. Compoziția exactă a dietei STD și GF este dată în tabelul 1. Conținutul de proteine ​​din dieta GF și dieta STD a fost similar (22,7% față de 22,9%). Proteinele din dieta STD au fost derivate din grâu (25%), porumb și soia, în timp ce sursa de proteine ​​din dieta GF a fost proteina din carne și soia. Cele două diete au avut, de asemenea, același conținut de aminoacizi, minerale, vitamine și oligoelemente. Conținutul de gliadină în dieta STD și GF (Tabelul 1) a fost măsurat prin testul GlutenTox ELISA Competitive (Diagnostic Biomedal, Sevilla, Spania). Greutatea șoarecilor a fost monitorizată și ambele grupuri de animale au prezentat o distribuție similară a greutății.

2.3. Incidența diabetului

Femelele NOD au fost inspectate zilnic pentru diabet și începând cu vârsta de 84 de zile au fost testate săptămânal pentru determinarea glicemiei utilizând monitorizarea glucozei FreeStyle Lite (Abbott). Diagnosticul de diabet s-a bazat pe două valori pozitive ale glicemiei> 12 mM cu un interval de două zile. Data primei citiri a glicemiei pozitive a fost utilizată ca dată de debut al diabetului. Șoarecii au fost uciși la debutul diabetului sau la vârsta de 310 zile. Dacă animalele au murit din alte cauze, acest lucru a fost observat, iar valorile au fost excluse la calcularea incidenței.

2.4. Scorul de insulită

Cinci șoareci din fiecare grup au fost folosiți pentru a evalua scorul insulitei. Pancreasul a fost îndepărtat, fixat în paraformaldehidă 4% peste noapte, încorporat în parafină și secționat în 4 μsecțiuni m care au fost ulterior colorate în hematoxilină și eozină. Secțiunile au fost evaluate aleatoriu și orbite prin microscopie. Fiecare secțiune a fost notată de la 0 la 4 conform următoarei scări: (0) insule intacte, (1) peri-insulită, (2) insulită moderată (50% din insulele infiltrate) și (4) insulă distrusă.

2.5. Izolarea ARN-ului

Probele jejunal au fost depozitate în RNAlater (Sigma, SUA) și ARN-ul a fost izolat folosind procedura TRIzol (Invitrogen, SUA). Țesuturile au fost omogenizate cu un Polytron PT10-35 (Kinematica, Elveția) la viteză medie timp de 10 s pe gheață. ARN a fost dizolvat în apă sterilă și precipitat cu acetat de sodiu. Calitatea și concentrația au fost măsurate pe un spectrofotometru NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, SUA).

2.6. Reacție în lanț cantitativă a polimerazei în timp real (RT-qPCR)

500 ng de ARN au fost transcrise invers în ADNc folosind qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences, SUA) conform protocolului producătorului. ADNc a fost diluat 1: 1 cu apă sterilă.

2.7. Analize statistice

Incidența cumulativă a diabetului a fost evaluată utilizând estimarea Kaplan-Meier și s-a utilizat un test log-rank pentru a calcula diferențele semnificative între grupuri. Datele RT-qPCR din grupurile de dimensiuni mici ale eșantionului au fost transformate în log și semnificația statistică a diferențelor a fost analizată prin ANOVA unidirecțională urmată de testul de comparație multiplă al lui Bonferroni. Datele RT-qPCR de la grupuri cu o dimensiune suficientă a eșantionului au fost analizate de către studenții nepereche

-Test. Datele sunt prezentate ca medie ± deviație standard (SD). Semnificația statistică (sau) este indicată de unul sau două asteriscuri în figuri, respectiv. GraphPad Prism versiunea 5.00 (software GraphPad, California) a fost utilizat pentru calcule.

3. Rezultate

În experimentele anterioare cu dieta GF la șoareci, animalele au fost hrănite cu dieta specială în timpul sarcinii, precum și postnatal. Pentru a clarifica care perioadă ar explica efectul benefic rezultat asupra dezvoltării diabetului de tip 1, am dat o dietă GF șoarecilor NOD în diferite momente de timp, așa cum se arată în Figura 1, variind de la dieta standard pe tot parcursul vieții lor (grupul I) la dieta GF exclusiv in utero (Grupa VI).

3.1. Descendenții care nu sunt expuși glutenului în Utero au cea mai mică incidență a diabetului

Incidența diabetului este prezentată în Figura 2. Incidența în grupul de control a fost de 62,5%, dar de până la 8,3% în grupul de animale care nu au fost expuse la gluten în uter (). Dintre animalele FG in utero, incidența a fost de 30% dacă șoarecii au primit o dietă FG după naștere (grupa IV), 36,4% dacă dieta a fost trecută la dieta STD la 3 săptămâni după naștere (grupa V) și 31,6% dacă mamele a primit o dietă GF înainte și în timpul sarcinii, dar nu după aceasta (grupa VII). Pe de altă parte, dacă șoarecii au primit dietă STD după naștere și dacă dieta GF a fost introdusă atunci când descendenții aveau vârsta de 4 sau 8 săptămâni (grupele II și III, respectiv), incidența a fost de 66,7% și respectiv 56,3%.


3.2. Descendenții mamelor la dieta GF în timpul sarcinii au avut o infiltrare mai mică a insulelor

Pentru a corela posibil activitatea pancreatică, imunologică, cu incidența bolii, am marcat infiltrarea insulei în secțiuni pancreatice de la șoareci din diferitele grupuri experimentale (Figura 3). În general, a existat mai puțină infiltrare în secțiuni de la șoareci care nu au fost expuși la gluten în viața fetală decât de la cârciumi de șoareci care au primit o dietă care conține gluten, dar nu o corelație directă. De exemplu, există o infiltrație mai mică în secțiunile din grupa II comparativ cu grupa I, deși incidența este aproape similară. De asemenea, infiltrarea în grupa VII pare mai mică, dar acest lucru nu se reflectă în incidență. Cu toate acestea, există mai puține infiltrări în secțiuni de la șoareci care nu sunt expuși la gluten in utero (grupele IV - VII) comparativ cu șoarecii expuși la gluten in utero (grupurile I - III) ().

3.3. Dieta GF în Utero reduce nivelul ROR intestinalγExpresia ARNm la descendenți

Deoarece limfocitele care se află la nivelul ganglionilor limfatici pancreatici locali, de asemenea, găzduiesc intestinul, este posibil ca modificările profilului imunologic din intestin să reflecte modificări ale pancreasului. Am efectuat qRT-PCR pe un număr de factori de transcripție a celulelor T diferiți pe țesuturile intestinale de la descendenți (șoareci NOD de 13 săptămâni) din fiecare grup diferit de dietă. Nivelurile de expresie în țesutul intestinal au fost semnificativ nealterate de dietă (Figura 4). Nu am găsit modificări induse de dietă în expresia Foxp3, T-bet, GATA-3, γδ, sau NKp46. Cu toate acestea, expresia RORγT, un factor de transcripție nucleară caracteristic pentru celulele Th17, a fost modificat semnificativ prin dietă. Când am comparat șoarecii expuși la gluten in utero (grupurile I - III) cu șoarecii care nu au fost expuși la gluten in utero (grupele IV - VII) am găsit un nivel semnificativ de expresie redus

din RORγt în grupurile GF. De asemenea, acesta a fost singurul factor care a avut în mod constant o expresie mai scăzută pentru aceste animale comparativ cu animalele care au experimentat gluten in utero. Alți markeri precum T-bet și Gata3 (markeri pentru diferențierea Th1 și Th2) și γδ Celulele T, caracteristice pentru limfocitele intraepidermice, nu au diferit. De asemenea, markerii pentru celulele T reglatoare (FoxP3) și celulele NK (NKp46) nu au diferit între diete.


4. Discutie

Am găsit o incidență remarcabil de scăzută a diabetului la descendenții de șoarece NOD, care a fost GF in utero. Deși ne-am așteptat ca incidența diabetului autoimun la descendenții șoarecilor NOD, care primesc dietă GF în timpul sarcinii, să fie mai mică decât la animalele de control, expunerea imediată la gliadină postnatal a dus la o frecvență a bolii mult mai mică decât la descendenții șoarecilor care au rămas o dietă GF.

Importanța unei diete GF în uter a fost găsită și într-un studiu recent [17]. Deși am observat și acest efect în studiul nostru (orice grup experimental, ale cărui mame au primit o dietă GF în timpul sarcinii, a avut o frecvență a bolii mai mică decât orice grup experimental ale cărui mame au primit gluten in utero), expunerea postnatală la gluten în studiul actual în continuare a redus semnificativ incidența bolii. Astfel, deși există un efect benefic al absenței glutenului în timpul sarcinii, pare să existe un efect benefic suplimentar al expunerii la gluten postnatal, care se reflectă în mare măsură în infiltrarea insulelor. Cu toate acestea, în unele cazuri (de exemplu, Grupul V și Grupul VI), se observă doar o diferență minoră în infiltrația insulelor, sugerând diferențe funcționale între infiltrate [19].

Mecanismele care stau la baza acestor observații nu sunt pe deplin elucidate, dar rezultatele altor investigații sugerează câteva explicații. Astfel, la șoarecii cărora li se administrează o dietă care conține gluten, glutenul creează un profil citokinic proinflamator în ganglionii limfatici pancreatici și duce la scăderea proporțiilor diferitelor subseturi de reglare T, inclusiv a celulelor T, în compartimentul limfoid al mucoasei [20, 21]. După cum am demonstrat recent că fragmentele de gluten sunt ușor absorbite din tractul intestinal după administrarea orală la șoareci [observație nepublicată], stimularea gliadinei ar putea avea loc și în pancreas, precum și în mucoasa intestinală. În prezent, nu este clar cum acest lucru se traduce printr-o activitate crescută a celulelor T îndreptate spre insulă, dar răspândirea antigenului și un nivel crescut de citokine în ganglionii limfatici ar putea ajuta probabil la activarea mai multor celule imune nespecific.

Acest mecanism ar putea explica de ce o dietă GF în timpul sarcinii este benefică, deoarece absența glutenului în acest moment ar lăsa șoarecii să reacționeze maxim la antigenii glutenului. Expunerea postnatală la gluten ar avea ca rezultat un răspuns imun crescut, iar glutenul nu ar ajunge apoi la insulele Langerhans. O altă explicație ar putea fi că introducerea glutenului postnatal ar putea avea ca rezultat un răspuns imun benefic în mucoasa intestinală față de gluten, probabil mediat de formarea unui răspuns imun de reglare la peptidele de gluten. Dacă glutenul este introdus numai după înțărcare (grupa V), sistemul imunitar este probabil prea dezvoltat și este deja orientat către insulele pancreatice, rezultând o incidență mai mare a bolii.

O observație interesantă este că incidența foarte scăzută a bolii (grupa VI) nu se găsește dacă mamele primesc și o dietă GF înainte de sarcină (grupa VII). O ipoteză de lucru pentru a explica acest lucru ar putea fi că absența glutenului ar scădea nivelul de insulină la mamă [observație nepublicată], ceea ce ar crește sensibilitatea la insulină și ar duce la valori mai scăzute ale glicemiei. Acest lucru ar întârzia maturarea insulelor la făt și nu ar expune astfel antigene ale celulelor beta înainte de închiderea barierei timusului. În acord cu acest lucru, injecțiile neonatale de glucoză reduc incidența bolii, probabil prin creșterea expresiei antigenului celulei beta și a inducerii toleranței [22]. Un analog uman cu acest mecanism îl reprezintă copiii mamelor diabetice care prezintă valori ridicate ale glucozei în uter și dezvoltă diabet cu o incidență mai mică comparativ cu copiii taților diabetici [23].

Traducerea directă a rezultatelor în boala umană ar fi aceea de a recomanda excluderea glutenului în timpul sarcinii, dar întrebarea este dacă ar putea afecta incidența bolii celiace. Anterior, investigațiile epidemiologice au demonstrat că momentul și modul de introducere a glutenului sunt esențiale pentru incidența bolii celiace mai târziu în viață, dar rezultatele recente din studiile prospective, randomizate la indivizi predispuși genetic au arătat că nu a existat un astfel de efect atunci când glutenul a fost introdus la 4, 6 sau 12 luni sau dacă copiii au fost alăptați sau nu. Același lucru s-a găsit la copiii care nu erau predispuși genetic [24]. Acest lucru sugerează că riscul de a dezvolta boala celiacă nu are legătură cu expunerea la gliadină. Prin urmare, ar putea fi interesant să testați recomandarea de mai sus într-un studiu uman prospectiv.

Interese concurente

Niciunul dintre autori nu declară niciun conflict de interese.

Contribuțiile autorilor

Julie C. Antvorskov a proiectat, efectuat și analizat experimentele. Julie C. Antvorskov și Knud Josefsen au scris lucrarea. Martin Haupt-Jorgensen a efectuat, analizat și a scris despre experimentele RT-QPCR. Karsten Buschard a supravegheat și editat ziarul. Petra Fundova a marcat infiltrarea insulelor în secțiunile pancreatice, iar David P. Funda a proiectat experimentul și a editat lucrarea. David P. Funda și Karsten Buschard împărtășesc autorul senior.

Mulțumiri

Lucrarea a fost susținută de subvenții de la Kirsten și Freddy Johansens Fond și parțial de Conceptul de cercetare instituțională RVO 61388971 și subvenția 15-24487S de la Agenția de granturi din Republica Cehă.

Referințe