Fosforilarea RSK la locul motivului hidrofob este diminuată în celulele perturbate mTORC2. (A) RSK are două domenii catalitice conservate, domeniile kinazei N-Terminal (NTKD) și C-Terminal (CTKD) care sunt fosforilate la fiecare dintre buclele lor de activare (T-Loop). Aceste două domenii flancează o regiune linker care este conservată printre kinazele AGC care conțin turnul conservat (TM) și motivele hidrofobe (HM) care devin fosforilate la siturile indicate. (B) MEF de tip sălbatic (WT) sau SIN1 -/- au fost crescute în DMEM complet (bazal; B) sau crescute apoi înfometate cu ser peste noapte. Serul a fost adăugat din nou și celulele au fost incubate timpii indicați (min) înainte de recoltare. Lizatele totale au fost preparate cu CHAPS conținând tampon și supuse SDS-PAGE și imunoblotare folosind anticorpi indicați. (C) Celulele HeLa au fost transfectate cu control scramble (scr) sau siRNA care vizează mTOR. Celulele au fost lizate folosind RIPA și procesate ca în B. (D) Timocitele cu ștergere de tip sălbatic (+/+), heterozigoți (+/−) sau homozigote (-/-) de rictor au fost lizate și supuse SDS-PAGE și imunoblotării. (E) Timocitele de tip sălbatic (WT) sau cu deficit de rictor nu au fost stimulate (0) sau stimulate cu anticorp CD3ε (10 μg/ml) pentru timpii indicați (min).

integral

Activarea ERK este esențială, dar nu suficientă pentru fosforilarea completă a sitului RSK HM. (A) Celulele HeLa au fost resuspendate în mediu complet fără ser, în prezența sau absența U2016 15 μM pentru timpii indicați. S-a adăugat 1 × FBS (ser) după cum s-a indicat, în ultimele 0,5 ore înainte de recoltare. Celulele au fost recoltate în tampon de liză CHAPS și extractele de proteine ​​au fost supuse SDS-PAGE și imunoblotare folosind anticorpi indicați. (B) MEF de tip sălbatic (WT) sau SIN1 -/- au fost crescute în DMEM complet (bazal; B) sau crescute apoi înfometate cu ser peste noapte. Serul a fost adăugat din nou și celulele au fost incubate timpii indicați (min). Celulele au fost recoltate și prelucrate ca în (A). (C) MEF WT sau SIN1 -/- au fost crescute peste noapte în absența serului, urmate de adăugarea de ser sau PMA pentru perioadele indicate. (D) WT sau rictor -/- timocitele nu au fost stimulate (0) sau stimulate cu Anti-CD3 și 10 ng/ml PMA pentru timpii indicați (min).

Fosforilarea sitului RSK HM este crescută în timpul retragerii nutrienților. (ANUNȚ). Creșterea HeLa (A - C) sau WT MEF (D) au fost resuspendate în medii cu sau fără FX dializat 1X (dFBS) sau 1 × dFBS așa cum se indică în (C, D) și lipsit (-) sau conținând (+) fie glucoză (A), glutamina (B) sau atât glucoza cât și glutamina (C, D) la momentele indicate. În (C, D), celulele au fost recoltate după 1 oră. Celulele au fost lizate cu tampon RIPA și procesate pentru SDS-PAGE și imunoblotare. (E) Celulele în creștere au fost resuspendate în mediu cu dFBS în absența sau prezența glucozei și/sau 500 μM 2-Deoxiglucoză (2DG) și incubate pentru perioadele indicate. (F) WT în creștere sau SIN1 -/- MEF au fost resuspendat în medii lipsite sau conținând glucoză, glutamină și/sau dFBS și incubat timp de 1 oră înainte de recoltare. Celulele au fost recoltate și procesate pentru SDS-PAGE și imunoblotare.

Fosforilarea S6 este diminuată în ciuda fosforilării RSK HM crescute în timpul retragerii nutrienților. (A) MEF-urile WT în creștere au fost resuspendate în mediu complet în prezența (+) sau absența (-) serului pentru perioadele indicate. Celulele au fost recoltate și procesate pentru SDS-PAGE și imunoblotare. (B, C) MEF-urile WT în creștere (B) sau HeLa (C) au fost resuspendate în mediu cu dFBS și lipsite fie de glucoză, glutamină, fie de glucoză și glutamină și incubate pentru perioadele indicate.

Activitatea catalitică a mTOR nu este necesară pentru fosforilarea situsului RSK HM. (A, B) MEF în creștere WT (A) sau celule HeLa (B) au fost suplimentate fie cu 1 μM Torin1, 1 × FBS (ser) sau ambele și incubate pentru timpii indicați. (C, D) MEF-urile WT în creștere au fost resuspendate în mediu cu dFBS, lipsite de (-) sau conținând) glutamină (C) sau glucoză (D). Torin1 (1 μM) sau vehicul (-) a fost adăugat în timpul resuspensiunii și incubat la orele indicate.

RSK și SIN1 se colocalizează la membrana plasmatică. MEF WT au fost co-transfectate cu GFP-SIN1β și mutant HA-RSK-WT sau HA-RSK-SA aviar (Ser381 Ala). După 48 de ore, celulele au fost restimulate cu ser timp de 15 minute. Colorarea și microscopia au fost efectuate pentru a detecta GFP, HA, precum și DiI (membrană) și DAPI (nucleu).

Substratul RSK CCTβ are fosforilare și expresie defectuoase în absența mTORC2. (A) Lizatele timocitelor de tip sălbatic (rictor +/+), rictor +/− sau rictor -/- au fost rezolvate prin SDS-PAGE și analizate pentru fosforilarea substraturilor RSK cunoscute prin imunoblotare. (B) MEF de tip sălbatic (WT) sau SIN1 -/- au fost crescute în DMEM complet (bazal; B) sau crescute apoi înfometate cu ser peste noapte. Celulele au fost apoi lăsate înfometate (-) sau serul a fost adăugat din nou și celulele au fost incubate pentru perioadele indicate. (C) WT sau SIN1 -/- MEF au fost transfectate cu control plasmidic Flag-CCTβ sau vector (vec). Celulele au fost înfometate și re-stimulate cu ser ca în B. Lizatele au fost supuse imunoprecipitării folosind anticorpul Flag. Imunoprecipitații au fost fracționați și șterse pentru fosforilarea CCTβ (folosind anticorpul substrat al motivului consensului Phospho-Akt (P-AS)) sau Flag. Extractele totale (input) au fost, de asemenea, fracționate prin SDS-PAGE și imunoblotate pentru pHM RSK sau CCTβ. (*) indică CCTβ de pavilion exogen, banda inferioară este CCTβ endogenă.

Model de reglementare mTORC2 a RSK. Ca răspuns la stimularea serului/factorului de creștere sau la retragerea nutrienților, fosforilarea RSK (prezentată în portocaliu) la locul motivului hidrofob (Ser380), situat în regiunea linker dintre NTKD (verde) și CTKD (galben), necesită un mTORC2 intact dar nu activitatea catalitică mTOR. SIN1 se asociază și se colocalizează cu RSK la membrana plasmatică. mTORC2 ar putea servi ca schelă pentru a potența fosforilarea RSK HM mediată de CTKD. CTKD este activat de ERK. mTORC2 este, de asemenea, necesar pentru fosforilarea substratului RSK CCTβ.