Laboratorul cheie de stat de științe criosferice, Institutul de Eco-Mediu și Resurse din Nord-Vest, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China

antioxidans

Laborator cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China

Colegiul de Geografie și Inginerie de Mediu, Universitatea orașului Lanzhou, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru deșert și deșertificare, Institutul de Eco-Mediu și Resurse din Nord-Vest, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru deșert și deșertificare, Institutul de Eco-Mediu și Resurse din Nord-Vest, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru deșert și deșertificare, Institutul de Eco-Mediu și Resurse din Nord-Vest, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China

Laboratorul cheie de stat de științe criosferice, Institutul de Eco-Mediu și Resurse din Nord-Vest, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China

Corespondenţă

Tuo Chen, Laboratorul cheie de stat pentru științe cioesferice, Institutul de Nord-Vest pentru Eco-Mediu și Resurse, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China.

Guangxiu Liu, Laboratorul cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China.

Laborator cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru deșert și deșertificare, Institutul de Eco-Mediu și Resurse din Nord-Vest, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China

Corespondenţă

Tuo Chen, Laboratorul cheie de stat pentru științe cioesferice, Institutul de Nord-Vest pentru Eco-Mediu și Resurse, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China.

Guangxiu Liu, Laboratorul cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China.

Laboratorul cheie de stat de științe criosferice, Institutul de Eco-Mediu și Resurse din Nord-Vest, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China

Colegiul de Geografie și Inginerie de Mediu, Universitatea orașului Lanzhou, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru deșert și deșertificare, Institutul de Eco-Mediu și Resurse din Nord-Vest, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru deșert și deșertificare, Institutul de Eco-Mediu și Resurse din Nord-Vest, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru deșert și deșertificare, Institutul de Nord-Vest pentru Eco-Mediu și Resurse, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China

Laboratorul cheie de stat de științe criosferice, Institutul de Eco-Mediu și Resurse din Nord-Vest, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China

Corespondenţă

Tuo Chen, Laboratorul cheie de stat pentru științe cioesferice, Institutul de Eco-Mediu și Resurse din Nord-Vest, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China.

Guangxiu Liu, Laboratorul cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China.

Laborator cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China

Laborator cheie pentru deșert și deșertificare, Institutul de Nord-Vest pentru Eco-Mediu și Resurse, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China

Corespondenţă

Tuo Chen, Laboratorul cheie de stat pentru științe cioesferice, Institutul de Nord-Vest pentru Eco-Mediu și Resurse, Academia Chineză de Științe, Lanzhou, China.

Guangxiu Liu, Laboratorul cheie pentru resurse și inginerie microbiană de mediu extrem, Lanzhou, China.

Abstract

1. INTRODUCERE

Acumularea de radicali liberi în organismele vii poate duce la numeroase boli, cum ar fi cancerul și bolile neurodegenerative (Fischer & Maier, 2015; Lin & Beal, 2006). Astfel, poate fi posibilă reducerea și prevenirea acestor boli cronice prin scăderea prezenței radicalilor liberi și creșterea aportului de antioxidanți (Bonda și colab., 2010; Fischer și Maier, 2015). Microorganismele sunt o sursă abundentă de metaboliți bioactivi (Berdy, 2005; Velho - Pereira, Parvatkar și Furtado, 2015). Prin urmare, pentru a preveni efectele toxice ale radicalilor liberi, antioxidanții naturali puternici au fost o țintă importantă pentru cercetători. Recent, explorarea de noi taxe pentru noi antioxidanți a fost una dintre strategiile eficiente folosite în această căutare.

Platoul Qinghai - Tibet este cel mai înalt platou din lume, unde altitudinea medie este peste 4.500 m (Zhang și colab., 2019). Datorită condițiilor stresante, cum ar fi temperaturile scăzute ale aerului, radiațiile UV ridicate și conținutul scăzut de oxigen atmosferic, organismele au trebuit să se adapteze pentru a supraviețui pe acest platou (Zhang și colab., 2018; Zhang, Tang și colab., 2016 ). Acest mediu este o sursă potențială de diversitate genetică și este un loc ideal pentru a căuta microbi producători de antioxidanți (Zhang, Wu și colab., 2016).

Conform cercetărilor noastre, un nou Planococ speciile de tulpini, Y74 T, au fost izolate din solul deșertic din Platoul Qinghai - Tibetan, China. Tulpina Y74 T a demonstrat o puternică activitate antioxidantă, care are potențiale aplicații antioxidante.

2. MATERIALE ȘI METODE

2.1 Izolarea bacteriilor

Probele de sol din deșert au fost obținute din orașul Huatugou, provincia Qinghai, China. Tulpinile Y74 T au fost izolate cu mediu de agar modificat de 216 L (per litru de apă distilată: 1,0 g acetat de sodiu, 10,0 g triptonă, 2,0 g extract de drojdie, 0,5 g citrat de sodiu, 0,2 g azotat de amoniu, 0,5 g mediu de bulion nutritiv, 20,0 g agar, pH 7,6) și incubat timp de 7 zile la 20 ° C, după care a fost conservat la -80 ° C în 20% (v/v) glicerol (Wang, Wang și Shao, 2010).

2.2 Secvențierea și analiza genomului

ADN-ul genomic a fost extras cu un kit de extracție a ADN-ului genomic bacterian (Omega Bio-tek, Inc.), conform instrucțiunilor producătorului, iar secvența a fost determinată de Illumina HiSeq 2000. Citirile din secvențiere au fost asamblate de novo folosind Velvet 1.2.10 program. Genomurile tulpinilor de tip care erau similare cu Y74 T au fost recuperate de la GenBank. Identitatea nucleotidică medie (ANI) și hibridizarea digitală ADN - ADN (dDDH) au fost utilizate pentru a evalua gradul de asemănare al fiecărei perechi. ANI a fost calculat cu JSpeciesWS (Richter, Rossello - Mora, Glockner și Peplies, 2016). ANI ar putea fi împărțit în ANIb și ANIm, în funcție de algoritmul BLASTN (Basic Local Alignment Search Tool) sau de instrumentul de aliniere ultrarapidă MUMMER. DDDH a fost calculat de un instrument online, GGDC 2.0: rezultatele acestui calcul au fost obținute utilizând formula 2 recomandată (Meier - Kolthoff, Auch, Klenk și Goker, 2013). Genomul tulpinii Y74 T a fost adnotat folosind IMG Annotation Pipeline v.5.0.3 (Chen și colab., 2019). Conținutul de G + C al ADN-ului tulpinii Y74 T a fost dedus din datele genomice. Analiza transferului de gene orizontale Y74 T prin metoda lui Bertelli, Laird și Williams (2017).

2.3 Analiza filogenetică

2.4 Analiza morfologică și fiziologică

Mărimea și morfologia celulei au fost determinate prin microscopie electronică cu scanare (JSM-5600, JEOL) utilizând celule imobilizate după pulverizarea aurului timp de 60 s. Pentru microscopia electronică cu scanare, tulpina Y74 T a fost fixată pe glutaraldehidă 4% timp de 8 ore. Ulterior, celulele au fost deshidratate într-o serie de etanol (15%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90% și 100%) timp de 10 minute fiecare. Culoarea coloniei a fost evaluată pe agar LB (Lysogeny Broth) (Oxoid).

Colorarea Gram a fost testată folosind kitul de colorare Solarbio Gram. Temperaturile de creștere (4, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 42 și 45 ° C) și concentrațiile de NaCl (0% -10%, greutate/volum, intervale de 0,5%) au fost determinate pe mediu 216L . Intervalul de pH pentru creștere a fost examinat cu tulpini cultivate la 28 ° C în mediu 216L, unde sistemul de tamponare (KH2PO4/HCI, KH2PO4/K2HPO4 și K2HPO4/NaOH) a fost injectat pentru a ajusta valoarea pH-ului de la 5 la 10 la 0,5 pH intervale de unitate. Activitatea oxidazei a fost detectată cu 1% (g/v) tetrametil-p-fenilendiamină. Hidroliza amidonului și a gelatinei, reducerea nitraților, activitatea catalazei, roșu de metil și testele Voges-Proskauer au fost efectuate conform descrierii lui Kurup și Schmitt (1973). A fost efectuat un test de utilizare a glucidelor așa cum s-a descris anterior (Zhang și colab., 2018). Activități enzimatice suplimentare au fost detectate de sistemele API ZYM.

2.5 Analiza chimiotaxonomică

Pentru analiza chemotaxonomică, celulele au fost colectate prin centrifugare din tulpini cultivate la 28 ° C în mediu TSB (per litru de apă distilată: 17,0 g triptonă, 3,0 g peptonă de soia, 2,5 g D-glucoză, 5,0 g clorură de sodiu, 2,5 g monopotasiu fosfat, pH 7,3) timp de 3 zile și apoi spălat de două ori cu apă distilată. Peptidoglicanul peretelui celular a fost analizat prin metoda lui Schleifer și Kandler (1972). Zaharurile din întreaga celulă au fost analizate prin metodele lui Lechevalier și Lechevalier (1970). Chinonele și lipidele polare au fost analizate prin metoda lui Collins și colab. și HPLC (Collins, Pirouse, Goodfellow și Minnikin, 1977; Kroppenstedt, 1982) și prin metoda lui Minnikin și colab. (1984), respectiv. Metilarea, extracția și analiza acizilor grași s-au bazat pe metodele lui Sasser (1990) și au fost identificate în baza de date TSBA 6.0 a sistemului Sherlock Microbial Identification (MIDI) (Kämpfer & Kroppenstedt, 1996).

2.6 Analiza activității antioxidante

Efectul peroxidului de hidrogen asupra creșterii tulpinii Y74 T a fost testat după cum urmează: un inocul de 100 μl de tulpină Y74 T în faza de creștere exponențială (OD600 = 0,6) a fost amestecat cu 50 ml mediu LB conținând 0, 1 și 5 mM H2O2 și apoi incubat la 30 ° C timp de 48 de ore. Concentrația celulară a fost monitorizată prin spectrofotometru (absorbanță la 600 nm). Toate experimentele au fost efectuate în trei exemplare. Curbele de montare a creșterii tulpinii Y74 T au fost trasate cu Origin 2018 (montare logistică neliniară).

Activitatea de eliminare a radicalilor 1,1-difenil-2-picrililhidrazil (DPPH) a fost testată în etape. Mai întâi, un inocul de 1 ml de tulpină Y74 T în faza de creștere exponențială (OD600 = 1,0) a fost centrifugat la 5.300 g timp de 10 min, după care supernatantul a fost aruncat și precipitatul a fost resuspendat cu 500 pl de PBS. Acest proces a fost repetat de trei ori. Precipitatul resuspendat a fost apoi amestecat cu 500 μl 0,4 mmol/L DPPH • etanol (grupul martor a folosit un volum egal de apă distilată), după care amestecul a fost lăsat să reacționeze în zona cu lumină slabă timp de 30 min la temperatura camerei și ulterior centrifugat la 5.300 g timp de 10 min. Absorbanța supernatantului a fost măsurată cu un spectrofotometru la 517 nm. Rata de eliminare a radicalilor liberi DPPH a fost calculată după cum urmează: activitate de curățare (%) = [1 - (As - Ab)/Ac] × 100%, unde Ab este absorbanța grupului gol, Ac este absorbanța controlului grup, și As este absorbanța setului de probe.

3. REZULTATE SI DISCUTII

3.1 Analiza filogenetică

Întregul secvențelor genei 16S ARNr a fost extras din genomul tulpinii Y74 T (1.512 pb, KU601236). Genomul tulpinii Y74 T a fost depus la DDBJ/EMBL/GenBank cu numărul de acces RCWH00000000.

96% și, respectiv, 70% (Chun și colab., 2018; Kim, Oh, Park și Chun, 2014; Meier-Kolthoff și colab., 2013). Din toate aceste motive, Antioxidanții planococului sp. noiembrie Y74 T a fost desemnat ca o specie nouă în gen Planococ.