Walker Julliard

* Divizia de chirurgie a transplantului, Departamentul de chirurgie, Facultatea de Medicină și Sănătate Publică a Universității din Wisconsin, Madison, WI, SUA

Travis De Wolfe

† Departamentul de Științe Alimentare, Universitatea din Wisconsin, Madison, WI, SUA

John H. Fechner

* Divizia de Chirurgie a Transplantului, Departamentul de Chirurgie, Facultatea de Medicină și Sănătate Publică a Universității din Wisconsin, Madison, WI, SUA

Nasia Safdar

‡ Divizia de Boli Infecțioase, Departamentul de Chirurgie, Facultatea de Medicină și Sănătate Publică a Universității din Wisconsin, Madison, WI, SUA

Rashmi Agni

§ Departamentul de patologie și medicină de laborator, Facultatea de medicină și sănătate publică a Universității din Wisconsin, Madison, WI, SUA

Joshua D. Mezrich

* Divizia de Chirurgie a Transplantului, Departamentul de Chirurgie, Facultatea de Medicină și Sănătate Publică a Universității din Wisconsin, Madison, WI, SUA

Date asociate

Abstract

Obiectiv

Pentru a determina efectele terapeutice ale suplimentării dietetice asupra infecției cu C. difficile (CDI).

fundal

Cu opțiuni de tratament limitate, creșterea bolii asociate cu Clostridium difficile a stimulat căutarea unor terapii noi. Datele recente definesc un rol pentru receptorii de hidrocarburi arii (AHR) și liganzi AHR derivați din dietă în imunitatea mucoasei. Am investigat eficacitatea indol-3-carbinolului (I3C), un supliment alimentar și ligand precursor AHR, într-un model murin de CDI.

Metode

Șoarecii C57BL/6 (B6), AHR -/- și AHR +/− au fost plasați pe diete pe bază de cereale sau semi-purificate cu sau fără I3C înainte și în timpul CDI. Șoarecii au fost urmăriți clinic timp de minimum 6 zile sau eutanasiați între zilele 0 și 4 de inoculare pentru analiza răspunsului inflamator și a microbiotei.

Rezultate

Șoarecii B6 hrăniți cu o dietă semi-purificată cu deficit de ligand AHR au crescut semnificativ severitatea bolii (p 1. Întreruperea microbiomului intestinal în urma utilizării antibioticelor este un factor de risc major pentru boala asociată cu C. difficile (CDAD) la om 2 Alți factori de risc includ vârsta, supresia acidului, imunosupresia, chirurgia gastro-intestinală și boala inflamatorie a intestinului 3-5. Tratamentul primar pentru infecțiile acute este antibioticele. Cu toate acestea, până la 20 la sută dintre pacienți prezintă recurență a CDI care poate fi rezistentă la tratamentul ulterior cu antibiotice. 6. Pentru acești pacienți, sunt testate noi terapii, cum ar fi probioticele și transplantul de microbiote fecale 7, 8. Eficacitatea probioticelor în prevenirea infecției a fost recent pusă în discuție 9, lăsând comunitatea medicală fără opțiuni de prevenire a bolilor care sunt susținute prin date, altele decât minimizarea utilizării antibioticelor și suprimarea acidului. Transplantul de fecale pentru boala recurentă/rezistentă a arătat unele promit 8, 10, dar barierele în calea adoptării sale includ dificultăți în controlul calității, probleme infecțioase și dozare.

În timp ce modelele murine au demonstrat importanța integrității microbiomului în minimizarea CDI 11, celulele imune gazdă și răspunsurile lor s-au dovedit a fi critice. Aceasta include prezența celulelor limfoide înnăscute din grupa 3 (ILC3s 12) și expresia IL-22 13. Receptorul de hidrocarburi arii (AHR) este esențial pentru dezvoltarea și menținerea ILC3-urilor, precum și a limfocitelor intra-epiteliale (IEL) ale intestinului 14, 15 și a șoarecilor plasați pe o dietă semi-purificată care nu conține fitochimicale (conținând minimum AHR). Liganzi) prezintă o scădere a numărului de celule IEL și ILC3 comparativ cu șoarecii de pe chow standard. Adăugarea ligandului precursor AHR indol-3-carbinol (I3C) la dieta purificată inversează această pierdere celulară 14, 15. Atât IEL cât și ILC3 sunt surse majore de IL-22 în intestinul 16, 17, iar AHR este vitală pentru exprimarea IL-22 în aceste subseturi de limfocite, precum și în celulele T convenționale 18, 19. În plus față de menținerea celulelor imune, liganții AHR derivați din dietă și microbiomi s-au dovedit a fi eficienți în tratarea/ameliorarea unei boli infecțioase diferite (candidoză vaginală) la suprafețele mucoasei la șoareci în mod dependent de IL-22 20 .

Folosind aceste informații, am emis ipoteza că includerea I3C în dietă ar putea reduce severitatea CDI. Pentru a testa această ipoteză, am folosit un model murin bine stabilit al CDAD 21. Dacă acesta este într-adevăr cazul, o astfel de constatare ar sugera că adăugarea unui supliment alimentar simplu și sigur începută cu puțin timp înainte de antibioticele planificate sau alte intervenții care cresc riscul de CDI poate avea eficacitate în reducerea morbidității din această boală foarte răspândită și sever debilitantă.

METODE

Șoarecii masculi C57BL/6j (B6) de 6-8 săptămâni au fost cumpărați de la Jackson Laboratory (Bar Harbor ME). Pentru unele experimente, șoarecii B6 au fost plasați fie pe un chow pe bază de cereale, fie pe un chow personalizat pregătit să conțină 1000 ppm I3C pe parcursul experimentelor. Pentru acele experimente în care se dorea o dietă săracă în liganzi AHR, șoarecii au fost plasați fie pe „dietă semi-purificată” (dietă semi-purificată AIN-76A; TestDiet, St. Louis, Mo), fie pe „dietă I3C” (AIN- 76A conținând 1000 ppm I3C) pentru restul studiului. Șoarecii heterozigoți AHR (AHR +/−), care au expresie AHR egală cu cea a șoarecilor de tip sălbatic B6, și șoarecii AHR nuli (AHR -/-) pe fundal C57BL/6J 22 au fost crescuți și menținuți în condiții specifice fără patogeni. Experimentele pe animale au fost efectuate în conformitate cu orientările instituționale. Toate procedurile au fost aprobate de Universitatea din Wisconsin Scoala de Medicina si Sanatate Publica IACUC.

Administrarea de antibiotice și infecția cu Clostridium difficile

Modelul a fost adoptat din metodele Chen 21. Șoarecii au fost monitorizați/scorați de două ori pe zi pentru semne de boală clinică și cântăriți în fiecare dimineață. Experimentul a fost încheiat atunci când toți șoarecii au fost eutanasiați pe baza următoarelor criterii: scoruri clinice> 13, scădere în greutate> 20% sau în ziua 7 după inoculare. Toate punctajele au fost făcute de anchetatori orbi la grupul experimental. Histologia cecală a fost examinată și notată de un singur histopatolog orb, așa cum este descris în supliment.

Colecție de țesuturi și scaune

O versiune modificată a unui protocol 23 publicat anterior a fost utilizată pentru a pregăti cecumul pentru histologie și RT-PCR. Fecalele de la șoareci au fost colectate și depozitate la -80 ° C până la procesarea ulterioară și analiza microbiomului.

Citometrie în flux

Celulele Cecal au fost colectate folosind o versiune modificată a unui protocol publicat anterior 24. Celulele IEL și lamina propria (LM) au fost analizate prin citometrie în flux.

analize statistice

Analiza statistică a fost efectuată utilizând software-ul GraphPad Prism. Pentru variabilele continue distribuite uniform, testul t exact al lui Fisher a fost utilizat pentru a compara mijloacele. Pentru seturile de date distribuite inegal, s-a aplicat o corecție Welch sau s-a aplicat un test Mann-Whitney U. Pentru a analiza supraviețuirea, grupurile au fost comparate folosind curbele de supraviețuire Kaplan Meier. Valorile p 5 spori de C. difficile (Fig. 1A). Șoarecii din dieta suplimentată cu I3C au avut o creștere semnificativă a supraviețuirii (66,7%) comparativ cu martorul (20%; Fig. 1B). Suplimentarea cu I3C a avut ca rezultat o scădere semnificativ mai mică în greutate în ziua 3 post-inoculare și scoruri reduse ale bolii în zilele 1, 2 și 5 (Fig. 1C, D). Ambele grupuri au prezentat scor mediu clinic maxim în ziua 3 după inoculare.

șoareci

(A) Procent de supraviețuire, (B) procentaj mediu în greutate +/− SEM și (C) scor clinic mediu +/− SEM după inoculare cu 10 5 VPI 10463 C. difficile la AHR masculin +/− și AHR -/- șoareci hrăniți chow standard. Datele au fost reunite din două experimente independente. (D, G) Procent de supraviețuire, (E, H) procentaj mediu în greutate +/− SEM și (F, I) scor mediu clinic +/− SEM după inoculare cu 10 4 VPI 10463 C. difficile al AHR masculin +/− ( Șoarecii D - F) sau masculi AHR -/- (G - I) hrăniți cu dietă semi-purificată (Diet) sau dietă semi-purificată suplimentată cu I3C (Diet + I3C) începând cu două săptămâni înainte de tratamentul cu ABx. Datele au fost reunite din două experimente independente. Șoarecii cu risc zilnic sunt indicați în panourile B, E, H. Testul log-rank a fost utilizat pentru analiza supraviețuirii, testul t cu două cozi a fost utilizat pentru compararea procentului zilnic de greutate, iar testul Mann-Whitney U a fost utilizat pentru compararea clinică Scor. * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01.

Modificarea celulelor imune ale mucoasei la șoarecii hrăniți cu dietă semi-purificată

(A și B) Expresia relativă Cyp1a1 și FoxP3 măsurată prin RT-PCR într-o dietă semi-purificată și șoareci I3C comparativ cu nivelurile de β-actină. (C) Parcele reprezentative de celule cecale izolate cu procent de populație părinte. (D - F) Grafice ale dietei semi-purificate și șoareci I3C în ziua 0, care demonstrează frecvența cregilor cLP (Live/CD45 +/CD11b -/Ly6G -/CD3 +/CD4 +/FoxP3 +; D), ILC3 (Live/CD45 +/CD11b -/Ly6G -/CD3 -/CD4 -/RORγt +; E) și numărul de celule T IEL γδ (Live/CD45 +/CD11b -/Ly6G -/TCRβ -/CD3 +/TCRγδ +; F ). Toate datele sunt reprezentative de n = 4 pe grup, cu bare de eroare care arată SEM, repetate în 2 experimente independente. * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01. Testul t al Studentului cu două cozi sau testul Mann-Whitney U utilizat pentru compararea mediilor.

Am luat în considerare posibilitatea ca diferitele diete să conducă la diferențe în microbiom care ar putea explica diferențele de supraviețuire după CDI. Așa cum se vede în Figura 1 suplimentară, diferența de pierdere a diversității dintre dieta semi-purificată și dieta suplimentată cu I3C (înainte sau după antibiotice) este mică și probabil nu ține cont de îmbunătățirea dramatică a supraviețuirii cu suplimentarea cu I3C.

Suplimentarea alimentară cu I3C crește răspunsul neutrofilelor, dar reduce inflamația

(A) Cecal C. difficile CFU/g fecale în dietă și dietă + șoareci I3C în ziua 2 și 4 (n = 4 pe grup). Limita de detectare indicată de linia de bord. Determinarea prezenței sau absenței C.fu cfu difficile pentru fiecare zi determinată prin analiza Chi-pătrat. (B și C) Diagrame reprezentative de flux și% de neutrofile cLP per celule CD45 + în ziua 0 (n = 4 pe grup) și ziua 3 (n = 8 per grup) după inoculare în dietă și dietă + șoareci I3C. (D și E) Histologie reprezentativă la 100x și 400x în dieta semi-purificată și șoareci I3C în ziua 3 (săgețile prezintă neutrofile) și scor histopatologic corespunzător (n = 10 per grup). (F) Expresia relativă a IL-22, IL-17 și IFN-γ în zilele 0 și 4, măsurată prin RT-PCR în dietă semi-purificată și dietă + șoareci I3C normalizați la β-actină (n = 4-10 per grup). (G) Măsurarea conținutului total de proteine ​​IL-22 și IL-17A per cecum de către ELISA.

Adăugarea de I3C în dietă scade translocația bacteriană în timpul CDI

Numărul de bacterii din omogenizările tisulare ale (A) splinei, (B) plămânului, (C) ficatului și (D) rinichiului în ziua 4 după CDI în dieta alimentată cu șoareci sau dietă + I3C. (E) Supraviețuirea, (F) pierderea în greutate și (G) scorurile clinice ale șoarecilor pe dietă semi-purificată tratați cu apă potabilă simplă sau apă potabilă cu ciprofloxacină 0,125 mg/ml începând cu o zi după inoculare cu 10 4 VPI 10463 C. difficile (n = 10 per grup). Toate barele de eroare arată SEM. * P ≤ 0,05; ** P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001. Testul log-rank utilizat pentru analiza supraviețuirii și testul Student cu două cozi sau testul Mann-Whitney U utilizat pentru compararea mediilor.

DISCUŢIE

În acest studiu, am demonstrat că adăugarea de I3C fie la chow standard pe bază de cereale, fie la dieta semi-purificată fără fitochimie a redus morbiditatea și mortalitatea asociată cu CDI într-un model murin. Această constatare are ramificații clinice importante, deoarece adăugarea I3C la dieta pacienților programată pentru viitoarele proceduri care includ antibiotice peri-procedurale sau pentru orice populație de pacienți despre care se știe că prezintă un risc crescut de CDAD, poate avea eficacitate în reducerea incidenței și/sau sau severitatea CDAD. Mai mult, dieta semi-purificată poate reprezenta mai bine populația la oameni care suferă cel mai rău cu CDI, mulți dintre care sunt subnutriți sau NPO (nil per os) în timp ce se află în spital. În plus, există potențialul ca pentru pacienții care au avut anterior CDI, adăugarea de I3C la dieta lor poate reduce incidența recurenței. Impactul acestor constatări este întărit de faptul că I3C este un supliment alimentar sigur, care a trecut deja prin studii clinice la oameni 28-30, este prezent în alimente și ar putea fi adăugat la dieta pacienților cu risc fără a fi nevoie de testare extinsă sau aprobare.

Studiile noastre care examinează mecanismul (mecanismele) controlului mediat de I3C al CDAD au utilizat dieta semi-purificată fără fitochimice cu și fără I3C. Cea mai izbitoare diferență în fenotipul șoarecilor din aceste diete s-a găsit în celulele imune ale intestinului. Mai exact, șoarecii suplimentați cu I3C au avut mai multe celule T Tregs, ILC3 și γδ T în intestin decât șoarecii din dieta cu deficit de ligand. Creșterea Tregs poate limita răspunsul imun la C. difficile la locul infecției și poate scădea patologia derivată de gazdă. Într-adevăr, în alte modele de colită, Tregs a jucat un rol critic în prevenirea bolii 34, 35. ILC3 joacă un rol crucial în rezistența gazdei la agenții patogeni intestinali, sunt surse importante de IL-22 în intestin și sunt implicate în prevenirea CDAD la șoareci 12. În cele din urmă, deși celulele T γδ nu au fost examinate în mod specific în C. difficile, sunt cunoscute că joacă un rol critic în menținerea imunității intestinale prin producerea de IL-22, IL-17 și alte citokine de protecție 18 și pierderea de aceste celule duc la creșterea bacteriană excesivă 15 .

Datele noastre susțin că protecția împotriva morbidității/mortalității în infecția cu C. difficile a fost secundară unei modulații a răspunsului imun, spre deosebire de o reducere a proliferării și creșterii C. difficile. Am luat în considerare posibilitatea ca deficiența dietei liganzilor AHR să ducă la mai multă disbioză și să lase acești șoareci mai sensibili la CDAD secundar modificărilor microbiomului. Au existat unele diferențe în profilul bacterian la șoarecii suplimentați cu I3C, care pot juca un anumit rol în protecția împotriva CDAD văzută în acest model. Dar, în general, șoarecii din ambele diete au avut mai multe asemănări decât diferențe, iar modificările ușoare observate sunt puțin probabil să explice pe deplin îmbunătățirea dramatică a rezultatului cu suplimentarea cu I3C. Un studiu anterior a identificat faptul că suplimentarea orală a enzimei intestinale a fosfatazei alcaline intestinale (IAP) în timpul tratamentului cu antibiotice protejează șoarecii de CDAD, posibil prin păstrarea florei intestinale normale 36. Deoarece acest lucru nu pare să fie mecanismul de protecție în suplimentarea I3C, poate fi interesant să se ia în considerare suplimentarea atât a IAP, cât și a I3C pentru o protecție mai robustă în studiile viitoare.