Secțiunea Interacțiuni gazdă-parazit de afiliere, Laboratorul paraziților intracelulari, Laboratoarele Rocky Mountain, Institutul Național de Alergii și Boli Infecțioase, Institutele Naționale de Sănătate, Hamilton, Montana, Statele Unite ale Americii

aducerea

Secțiunea Interacțiuni gazdă-parazit de afiliere, Laboratorul paraziților intracelulari, Laboratoarele Rocky Mountain, Institutul Național de Alergii și Boli Infecțioase, Institutele Naționale de Sănătate, Hamilton, Montana, Statele Unite ale Americii

Afiliere Secțiunea Coxiella Patogeneză, Laboratorul de paraziți intracelulari, Laboratoarele Rocky Mountain, Institutul Național de Alergii și Boli Infecțioase, Institutele Naționale de Sănătate, Hamilton, Montana, Statele Unite ale Americii

  • Anders Omsland,
  • Ted Hackstadt,
  • Robert A. Heinzen

Cifre

Citare: Omsland A, Hackstadt T, Heinzen RA (2013) Bringing Culture to the Uncultured: Coxiella burnetii and Lessons for Obligate Intracellular Bacterial Agents. PLoS Pathog 9 (9): e1003540. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003540

Editor: Virginia Miller, Universitatea din Carolina de Nord la Școala de Medicină Chapel Hill, Statele Unite ale Americii

Publicat: 5 septembrie 2013

Acesta este un articol cu ​​acces liber, lipsit de orice drept de autor și poate fi reprodus, distribuit, transmis, modificat, construit sau utilizat în orice mod de către oricine în orice scop legal. Lucrarea este pusă la dispoziție sub dedicarea domeniului public Creative Commons CC0.

Finanțarea: Această lucrare a fost finanțată de Programul de cercetare intramurală al Institutelor Naționale de Sănătate, Institutul Național de Alergii și Boli Infecțioase. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Cunoscute fiziologie și microbiologie celulară au uns roțile pentru dezvoltarea burnetii axenice

Microbiologia celulară și proprietățile metabolice cunoscute ale altor obligați oferă o perspectivă asupra condițiilor care ar putea sprijini creșterea axenică. C. trachomatis se replică într-o vacuolă deconectată de la calea endocitară [8]. Compartimentul este permeabil în mod liber la ionii citoplasmatici și are un pH de 7,2 [9]. Livrarea de nutrienți meditată vezicular este invocată pe baza interacțiunilor vacuole cu corpuri multivesiculare, picături de lipide și vezicule derivate de Golgi [10]. Activitățile metabolice definite ale chlamidiei purificate includ transportul și oxidarea glucozei-6-fosfat [11]. Vacuolele care adăpostesc E. chaffeensis și A. phagocytophilum seamănă cu endosomii timpurii și, respectiv, cu autofagosomii, cu pH-uri prezise ușor mai mici decât neutralitatea [12], [13]. Studiile de trafic intracelular sugerează accesul la cantități suficiente de aminoacizi [12], [13]. Rickettsia spp. replică în mediul bine definit al citoplasmei gazdă și, similar cu C. trachomatis, elimină ATP de la gazdă prin activitatea unei translocaze ATP/ADP [14].

In Silico Path Reconstruction dezvăluie capacitatea metabolică

Nu uitați de oxigen

Concentrația scăzută de oxigen (1-5%) a fost esențială pentru creșterea axenică a C. burnetii, un rezultat care pare contraintuitiv având în vedere că bacteria crește prodigios în celulele gazdă cultivate în oxigen ambiental (~ 21% O2). Cu toate acestea, concentrația de oxigen intracelular a celulelor cultivate este, în general, mai mică decât concentrația extracelulară [21], iar țesuturile au o gamă de niveluri de oxigenare care pot fi cu mult sub nivelurile ambientale [22].

Impulsul pentru testarea nivelului scăzut de oxigen a apărut în urma analizei genomului care arată că C. burnetii codifică citocromul bd oxidaselor terminale și citocromul o. Astfel, C. burnetii a apărut adaptabil la creșterea în concentrații diferite de oxigen, deoarece citocromul bd și citocromul o, pe baza afinităților O2, sunt de obicei utilizate în condiții microaerobe și, respectiv, aerobe. C. trachomatis, R. rickettsia și R. prowazekii codifică, de asemenea, citocromul bd, ceea ce implică un mediu microaerob ar putea fi optim pentru creșterea axenică a acestor organisme. Alți obligați ar putea prefera pur și simplu un mediu cu conținut scăzut de oxigen pentru a reduce stresul oxidativ.

Noțiuni de bază

Fiziologia cunoscută a agenților patogeni, caracteristicile de nișă și capacitatea metabolică prezisă oferă o bază pe care să se înceapă o abordare treptată a dezvoltării mediilor axenice. Două considerații tehnice importante înainte de a începe sunt 1) obținerea unor cantități adecvate de bacterii extrem de pure pentru testare și 2) dezvoltarea unui test simplu pentru a evalua capacitatea metabolică. Bacteriile intracelulare obligatorii sunt de obicei cultivate în cultura țesuturilor - un sistem de creștere care necesită un protocol extins de purificare pentru a elimina preparatele bacteriene de materialul celulelor gazdă contaminante - cu cele mai problematice contaminări pentru studiile metabolice fiind mitocondriile. Incorporarea aminoacizilor radioactivi în proteine ​​reflectă un proces biosintetic bazat pe activitatea căilor metabolice majore și, prin urmare, este o analiză informativă și ușoară a activității metabolice globale. Sinteza proteinelor C. burnetii a fost măsurată prin numărare de scintilație și/sau electroforeză pe gel și autoradiografie după incubare în diferite formulări de medii conținând [35 S] cisteină-metionină.

Prima componentă media care a fost identificată este un tampon permissiv din punct de vedere metabolic având un pKa în apropierea pH-ului prevăzut al nișei intracelulare a bacteriei. Testarea tampoanelor care conțin [35 S] cisteină-metionină și glutamat ușor metabolizat a arătat că tamponul citrat a fost optim pentru sinteza proteinelor C. burnetii [23]. Diverse amestecuri de sare care furnizează concentrații fiziologice de ioni pot fi apoi testate, din nou cu o compoziție bazată pe habitate intracelulare. După cum s-a speculat, C. burnetii a preferat nivelurile serice de Na +, K + și Cl - și a fost deosebit de sensibil la concentrația de Cl [23]. Tamponul rezultat a fost suplimentat cu substanțe nutritive (de exemplu, ser fetal bovin [FBS]) prezis a fi transportat din mediul extracelular gazdă la CCV prin endocitoză în fază fluidă. Neopeptona a fost adăugată ca sursă de carbon în vrac și de energie pe baza preferinței cunoscute și prezise de Coxiella pentru aminoacizi/peptide [23].

În timpul dezvoltării mediului C. burnetii, activitatea metabolică a continuat să se îmbunătățească, dar creșterile echivalenților genomului prin PCR cantitativă nu au fost detectate. Astfel, pentru a obține o perspectivă asupra deficiențelor potențiale ale mediului, au fost comparate transcriptomii C. burnetii incubați în medii și crescând în celulele gazdă Vero [24]. Așa cum era de așteptat, profilele transcripționale ale genei au fost foarte discordante. Cu toate acestea, a fost observată o reglare marcată a expresiei genelor ribozomale de către bacteriile cultivate axenic, sugerând că, în ciuda prezenței unei surse bogate de aminoacizi (neopeptonă), mediile erau încă deficitare în aminoacizi. A fost apoi testată o sursă diferită de aminoacizi, acizii casamino. În plus, mediul a fost suplimentat cu o concentrație mare (1,5 mM) de L-cisteină pe baza cerinței similare pentru creșterea axenică a Legionella pneumophila, o rudă apropiată a lui C. burnetii. Acizii casamino și L-cisteina au avut un efect aditiv asupra capacității metabolice în condițiile oxigenului ambiental (~ 21%), dar din nou, replicarea bacteriană nu a fost observată.

Rezultatele negative ale creșterii au determinat o evaluare a replicării C. burnetii la niveluri scăzute de oxigen. Când C. burnetii a fost incubat într-un mediu numit acum mediu acid citrat cisteină (ACCM) în 2,5% oxigen, a avut loc o creștere puternică (~ 3 log10 în 6 zile). În Figura 1 este prezentat un rezumat al unei abordări sistematice a dezvoltării mediilor axenice de creștere pentru bacteriile intracelulare obligatorii.

(A) Predicțiile bazate pe caracteristicile de nișă, reconstrucțiile căilor metabolice și fiziologia cunoscută a organismelor purificate pot fi utilizate pentru a stabili pH-ul mediului inițial și compozițiile. Tensiunea oxigenului trebuie testată empiric. (B) Testarea treptată a formulărilor mediatice și a tensiunii oxigenului pentru a găsi condiții care susțin capacitatea metabolică crescută utilizând indicatori informativi ai activității metabolice, cum ar fi SDS-PAGE/autoradiografie și microarrays transcripționale. Titrările tuturor elementelor constitutive ale mediului ar trebui efectuate deoarece concentrațiile ridicate ale unora pot fi inhibitori [23]. (C) Analize de creștere pentru a determina dacă creșterea capacității metabolice se corelează cu creșterea numărului de bacterii. Infectivitatea, densitatea optică și/sau echivalenții genomului bacteriilor de intrare pot fi comparate cu bacteriile de ieșire după incubare.

Chlamydia: O lucrare în curs

Două rapoarte recente susțin ideea că creșterea axenică a C. trachomatis poate fi posibilă prin respingerea dogmei conform căreia corpul elementar infecțios (EB) care nu se reproduce este incapabil de metabolism în afara unei celule gazdă eucariote [11], [25]. Haider și colab. [25] a arătat prin microspectroscopie și autoradiografie Raman că fenilalanina marcată este încorporată de EB în timpul incubației extinse în DGM-21A, un mediu care, în mod interesant, este optimizat pentru creșterea Acanthameoba sp. Omsland și colegii săi [11] au dezvoltat ulterior un nou mediu CIP-1 bazat pe tampon de fosfat care susține metabolismul pronunțat al C. trachomatis fără celule gazdă. Pe baza caracterizării anterioare a vacuolului care conține chlamydia [9], CIP-1 are concentrații de ioni și un pH care imită citoplasma gazdă. Mai mult, datele bioinformatice și fiziologia cunoscută au determinat adăugarea glucozei-6-fosfat și a ditiotreitolului, precum și a FBS, toți aminoacizii și patru nucleotide trifosfați, pentru a explica auxotrofiile. Rezultatele fundamentale ale acestui studiu includ (1) glucoza-6-fosfatul este o sursă de energie preferată a EB; (2) corpurile reticulate replicative (RB), dar nu EB, necesită ATP exogen ca sursă de energie; și (3) condițiile microaerobe sporesc activitatea metabolică.

Extindere la flora normală neculturabilă

Concluzii finale

Este rezonabil să se reclasifice C. burnetii ca bacterie intracelulară facultativă, deși această denumire poate fi dezbătută pe baza absenței unui mediu natural definit care să susțină creșterea extracelulară [30]. Creșterea axenică a alimentat noi domenii importante de cercetare, inclusiv dezvoltarea unui set complet de instrumente genetice [31]. Nu există un motiv evident pentru care creșterea axenică similară nu poate fi realizată pentru Anaplasma, Ehrlichia, Chlamydia, Orientia și Rickettsia. Cu excepția Orientiei, aceste bacterii conțin un genom substanțial redus față de genomul abase2 megabazei C. burnetii care poate prezenta o barieră mai mare de depășit în căutarea creșterii axenice. Cu toate acestea, o abordare sistematică similară care exploatează comportamente fiziologice cunoscute și prezise și persistența în testare, s-ar putea dovedi reușită în salvarea acestor obligați din celula gazdă.

Mulțumiri

Mulțumim Anitei Mora pentru ilustrațiile grafice.