• Găsiți acest autor pe Google Scholar
  • Găsiți acest autor pe PubMed
  • Căutați acest autor pe acest site
  • Pentru corespondență: jonathan.cohen @ utsouthwestern.eduhelen.hobbs @ utsouthwestern.edu

Contribuit de Helen H. Hobbs, 19 martie 2019 (trimis spre examinare 4 februarie 2019; revizuit de Edward A. Fisher și Rudi Zechner)

este

Semnificaţie

O variantă de secvență (I148M) în PNPLA3 este un factor de risc genetic major pentru boala hepatică grasă nealcoolică. Anterior, am arătat că PNPLA3 (148M) evită degradarea mediată de ubicuitate și se acumulează la niveluri ridicate pe picăturile de lipide (LD). Aici abordăm modul în care această acumulare este legată de steatoză. Am generat o izoformă activă, rezistentă la ubicuitate, care s-a acumulat pe LD și a crescut nivelul de trigliceride hepatice atunci când este exprimat în ficatul șoarecilor. În schimb, epuizarea PNPLA3 a rezolvat acumularea excesivă de grăsime hepatică asociată cu expresia PNPLA3 (148M). Rezultatele noastre oferă dovezi directe că acumularea de PNPLA3 în sine cauzează ficatul gras și că epuizarea proteinei este o strategie potențială pentru intervenția terapeutică.

Abstract

Boala hepatică grasă nealcoolică (FLD) este o tulburare metabolică în plină dezvoltare în care caracteristicile bolii hepatice asociate alcoolului se dezvoltă la persoanele care consumă puțin sau deloc alcool (1). Acumularea trigliceridelor (TG) în ficat (steatoză hepatică) este prima etapă a tulburării. La un subgrup de indivizi, steatoza este asociată cu un răspuns inflamator (steatohepatită) care poate evolua către ciroză și chiar carcinom hepatocelular (2). Principalul factor de risc pentru FLD nealcoolic este obezitatea, dar factorii genetici joacă un rol major în sensibilitatea (și rezistența) la tulburare (2 ⇓ ⇓ –5). Anterior, am identificat o variantă nesinonimă (I148M) în proteina 3 conținând domeniul fosfolipazei asemănătoare patatinului (PNPLA3) care este asociată cu spectrul complet al FLD atât alcoolic cât și nonalcoolic (6 ⇓ ⇓ ⇓ –10). Deși PNPLA3 (148M) este cel mai frecvent și mai puternic factor de risc genetic pentru FLD nealcoolic (3, 11), mecanismul prin care această variantă crește nivelul TG hepatic rămâne evaziv.

Aici ne întrebăm dacă acumularea de PNPLA3 (148M sau 47A) pe LD este o cauză sau o consecință a steatozei asociate. Dacă acumularea de PNPLA3 în sine este cauzală, atunci acumularea proteinei WT, care este de obicei menținută la niveluri scăzute (16), ar trebui să ducă la FLD. În schimb, reducerea cantității de PNPLA3 (148M) ar trebui să elimine fenotipul FLD. Pentru a testa această ipoteză, am folosit două strategii complementare: În primul rând, am conceput o formă a proteinei WT care a păstrat activitatea, dar a evitat degradarea proteazomală și, astfel, s-a acumulat la niveluri ridicate pe LD. Exprimarea acestei izoforme a cauzat steatoză hepatică la șoareci WT. În al doilea rând, am redus nivelurile de PNPLA3 (148M) pe LD folosind două metode diferite: (i) shRNA pentru a doborî expresia PNPLA3 și (ii) degradarea mediată a proteinei de chimeră (PROTAC) a PNPLA3 Halo-tagged (148M). Ambele strategii au scăzut nivelul PNPLA3 la LD și au redus steatoza hepatică.

Rezultate

Inhibarea autofagiei promovează acumularea de PNPLA3.

Anterior, am arătat că PNPLA3 (WT) este poliubiquitate și degradat de proteazomi (18). Tratamentul cu inhibitorul proteazomului bortezomib are ca rezultat o creștere a PNPLA3 hepatic la șoareci WT, dar nu și la șoareci care exprimă izoforma 148M (18). În schimb, tratamentul cu un inhibitor al macroautofagiei, 3-metiladenina (3-MA), nu a reușit să modifice nivelurile PNPLA3 (18). Cu toate acestea, eficacitatea 3-MA ca inhibitor al macroautofagiei a fost contestată (19). Prin urmare, pentru a evalua în continuare rolul autofagiei în degradarea PNPLA3, am folosit doi inhibitori alternativi ai căii.

În primul rând, am tratat șoareci transgenici care exprimă fie PNPLA3 (WT), fie PNPLA3 (148M) cu clorochină (25 mg/kg) timp de 3 ore (20) (Fig. 1A, Superior). La șoarecii PNPLA3Tg WT, tratamentul cu clorochină a crescut nivelul PNPLA3 la LDs de 20 de ori, comparativ cu controlul vehiculului. Modificările nivelurilor de proteine ​​PNPLA3 nu au fost asociate cu modificările nivelurilor de ARNm PNPLA3 (Fig. 1B). Spre deosebire de șoarecii care exprimă transgena WT, tratamentul cu clorochină nu a avut niciun efect asupra nivelurilor PNPLA3 la șoarecii PNPLA3Tg 148M. Ca un control pozitiv pentru inhibarea autofagiei mediată de clorochină, am monitorizat nivelurile de sequestozom 1 (SQSTM1)/p62, un substrat autofagic (21). Tratamentul cu clorochină a dus la creșteri comparabile ale nivelurilor de p62 la cele două linii de șoareci transgenici. În ciuda nivelurilor crescute de PNPLA3 la șoarecii PNPLA3Tg WT, nu s-a observat nicio modificare a nivelului TG hepatice (Fig. 1A, inferior).

Acumularea de TG hepatic în PNPLA3 rezistent la ubicuitate. O schemă a PNPLA3 care arată locația reziduurilor de lizină care au fost schimbate în arginine fie în proteina totală [PNPLA3 (K → R)] (n = 19), fie doar în domeniul patatin [PNPLA3 (PAT: K → R)] (n = 12). Șoarecii masculi WT (n = 7 per grup, cu vârsta cuprinsă între 8 și 11 săptămâni) au fost infectați cu AAV (1,25 × 10 11 GC) care nu conțin insert (V) sau cu AAV care exprimă PNPLA3 (WT), PNPLA3 (148M), PNPLA3 (PAT ): K → R) (în care cele 12 lizine din domeniul patatinei au fost înlocuite cu arginine), sau [PNPLA3 (K → R)] (în care toate cele 19 lizine din proteină au fost înlocuite cu arginine). Șoarecii au fost hrăniți cu HSD timp de 3 săptămâni și apoi plasați pe un protocol de sincronizare dietetică. După protocolul 3-d, șoarecii au fost uciși, iar LD-urile au fost izolate de ficat. Un total de 2 μg de proteină LD a fost supus analizei imunoblotului cu un anti-PNPLA3 mAb (11C5) și un anti-PLIN2 policlonal Ab (Metode). Semnalele au fost cuantificate folosind un sistem de imagistică LI-COR. TG-urile au fost măsurate din lizatele hepatice utilizând un test enzimatic. Fiecare bară reprezintă valori medii ± SEM. * P 148M/M Șoareci.

Pentru a testa ipoteza că reducerea expresiei Pnpla3 ar atenua ficatul gras la șoarecii Pnpla3 148M/M, am folosit AAV-uri pentru a exprima un shRNA care vizează Pnpla3 în ficatul șoarecilor. Am folosit o dietă bogată în fructoză de 2 săptămâni pentru a obține acumularea de PNPLA3 și un fenotip FLD (Anexa SI, Fig. S3). Expresia shARN-ului Pnpla3 la șoarecii alimentați cu fructoză a abrogat complet expresia PNPLA3 (Fig. 4) și a fost asociată cu o reducere a nivelurilor de TG hepatică care nu a fost observată la șoarecii infectați cu ShRNA Scr sau în grupurile de control tratate cu PBS (Fig. 4). Aceste rezultate sugerează că acumularea de PNPLA3 în sine provoacă steatoza asociată cu varianta PNPLA3 (148M). Important, acest experiment implică, de asemenea, că intervențiile care scad în mod eficient nivelurile PNPLA3 vor inversa steatoza la persoanele cu varianta PNPLA3 (148M).

Anticorpi.

Anticorpii utilizați pentru analiza imunoblotului și imunofluorescența în acest studiu sunt descriși în anexa SI, Metode.

Plasmide.

Plasmidele utilizate pentru analiza imunoblotului și microscopia de imunofluorescență sunt descrise în apendicele SI, metode.

Chimia ficatului.

Lipidele au fost extrase din alicote hepatice (100 mg) (37). Colesterolul și TG-urile au fost măsurate utilizând teste enzimatice (Infinity, Thermo Electron și, respectiv, Wako). Valorile au fost normalizate la greutatea probei.

Expresie ARN Messenger.

ARN-ul total a fost preparat din țesuturile șoarecilor așa cum este descris (38). Nivelurile transcrierilor au fost măsurate folosind PCR în timp real, cu toate reacțiile efectuate de trei ori. Cantitățile relative ale transcrierilor de ARNm de interes au fost comparate cu cele ale mouse-ului 36B4 (control intern) și exprimate folosind metoda ciclului de prag comparativ (Ct) (38).

Viruși asociați adeno.

Construcțiile AAV recombinate care exprimă un shRNA care vizează PNPLA3 au fost generate intern. Construcțiile AAV-PNPLA3-shRNA au fost realizate folosind secvențe de shRNA care au vizat exonii 4 până la 7 ai mouse-ului Pnpla3 (11) așa cum este descris în apendicele SI, Metode. Toate celelalte AAV-uri au fost achiziționate de la Vector Biolabs.

Tratamentul cu bortezomib.

Șoarecii au fost hrăniți cu HSD ad libitum timp de 4 săptămâni și apoi sincronizați și tratați cu bortezomib (1 mg/kg) așa cum este descris în apendicele SI, Metode.

Tratamentul cu clorochină.

Șoarecii hrăniți cu HSD timp de 4 săptămâni au fost sincronizați și apoi tratați cu clorochină (25 mg/kg) așa cum este descris în apendicele SI, Metode.

Tratamentul PROTAC3.

Șoarecii au fost hrăniți cu HSD timp de 2 săptămâni și apoi tratați cu PROTAC3 (Promega; CS2072A01; 479 μg pe flacon) așa cum este descris (39). Pe scurt, PROTAC3 în DMSO (60 μL) a fost diluat 1:20 (vol/vol) în ser fiziologic și injectat (4,8 mg/kg în 200 μL) prin vena cozii de trei ori pe săptămână timp de 2 săptămâni. Șoarecii au fost menținuți pe un HSD până în ultimele 3 zile ale experimentului, când dieta a fost sincronizată așa cum s-a descris mai sus. Ficăcii au fost recoltați și LD au fost izolați (40).

Imunoblotarea.

Țesutul hepatic (50 până la 100 mg) a fost omogenizat în tampon RIPA (150 mM NaCI, 1,0% IGEPAL CA-630, 0,5% deoxicolat de sodiu, 0,1% SDS și 50 mM Tris, pH 8,0) suplimentat cu inhibitori de protează (amestec de inhibitori de protează); Roche). S-au preparat lizate și LD și s-a efectuat imunoblotarea așa cum s-a descris anterior (41). Benzile au fost vizualizate folosind SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrat (Thermo Fisher Scientific) și cuantificate folosind LI-COR Odyssey System.

Microscopie de imunofluorescență.

Celulele QBI-293A au fost cultivate în mediu complet (DMEM cu glucoză ridicată, 5% FCS), transfectate și analizate prin microscopie imunofluorescentă așa cum este descris în apendicele SI, Metode.

Izolarea LD și imunoprecipitarea PNPLA3.

LD-urile au fost izolate așa cum s-a descris anterior (16). Analiza imunoblot a fost efectuată așa cum este descris în apendicele SI, Metode.

Mulțumiri

Mulțumim Serenei Banfi, Tommy Hyatt, Christina Zhao, Liangcai Nie, Fang Xu, Maritza Thomas, Lizbeth Solis, Jeffrey Cormier și Lisa Beatty pentru asistență tehnică, și Amandei Lowe, Nancy Heard și Chelsea Burroughs pentru sprijin administrativ. S.B.R. a fost sprijinit de un premiu postdoctoral de bursă de cercetare de la American Liver Foundation și un Junior Faculty Research Award de la National Lipid Association. J.C.C. și H.H.H. au fost susținute de subvenții de la Institutele Naționale de Sănătate (R01 DK090066 și P01 HL200948).

Note de subsol

  • ↵ 1 Cui îi poate fi adresată corespondența. E-mail: jonathan.cohenutsouthwestern.edu sau helen.hobbsutsouthwestern.edu .