Marcați/Căutați această postare

Jonathan H. Hall (1) și Dahn L. Clemens (1,2)

Tipul metodelor:

Versiune de intrare:

Citare:

Dimensiune atașament
Utilizarea Coxsacklevirus B3 ca model de pancreatită acută.pdf 497,11 KB

1. Introducere

Pancreatita acută este o boală gastroenterologică gravă caracterizată prin inflamație și deteriorarea pancreasului exocrin. În general, se autolimită, dar în până la 20% din cazurile de complicații clinice severe se dezvoltă, rezultând pancreatită acută severă, cu o rată de mortalitate de până la 30% (25, 39, 40). Pancreatita acută severă este asociată cu inflamație sistemică, insuficiență multi-organ și mortalitate ridicată. Din păcate, în prezent nu există farmacoterapie specifică pentru a trata sau preveni progresia acestei boli.

Cei mai comuni factori etiologici asociați cu pancreatita acută la adulți sunt calculii biliari și abuzul de alcool, deși în 20-30% din cazuri cauza nu este cunoscută (6). În contrast, factorii etiologici comuni la copii includ medicamente, infecții, traume și anomalii anatomice (32). Interesant, într-o revizuire a literaturii Benifla și Weizman au raportat că aproximativ 10% din cazurile pediatrice de pancreatită acută au rezultat din infecții virale (3).

2. Materiale și reactivi

2.1 Materiale

  1. Agaroză
  2. Powdered Dulbecco’s Modified Eagle’s Media
  3. Ser fetal bovin
  4. Rotor și tuburi Bechman SW 28 sau SW 41
  5. Formaldehida
  6. Violet de cristal
  7. Omogenizatoare de sticlă (Râșnițe de țesut)
  8. 12 plăci de cultură de țesuturi

2.2 Reactivi

A. Preparare 0,5% Agaroză/DMEM

Soluția 0,5% agaroză/DMEM se realizează prin prepararea a 2 soluții separate: o soluție 1% de agaroză și o soluție de 2X DMEM. Soluția de agaroză 1% se prepară prin adăugarea a 1 gram de agaroză/100 ml apă distilată și sterilizată prin autoclavare. Soluția de agaroză este apoi răcită într-o baie de apă la 55 o C. Soluția 2X DMEM este preparată prin adăugarea de două ori a greutății recomandate de pulbere DMEM și bicarbonat de sodiu la volumul pe care doriți să îl preparați (în mod normal, 100 mL). PH-ul este ajustat la 7,2, este sterilizat prin filtru printr-un filtru de 0,22 μm și încălzit la 55 o C. Soluția 0,5% de agaroză/DMEM este preparată prin combinarea volumelor egale de soluții de agaroză și 2X DMEM imediat înainte de a o utiliza pentru suprapunere celulele.

b. Prepararea 20% formalină

Formalina este o soluție stoc de 37% formaldehidă. Pentru a prepara 20% formalină, soluția stoc de formalină se diluează 1: 5 folosind apă distilată rezultând 7,4% formaldehidă

c. Preparare 1% cristal violet

Violetul cristal este preparat prin adăugarea a 5 g de violet cristal la 395 ml H2O și 105 ml etanol 20%. Soluția este apoi filtrată printr-un filtru de 0,22 μm.

3. Metode

Virușii CVB3 sunt agenți patogeni umani (26, 34). Din acest motiv, atunci când lucrați cu CVB3, trebuie folosite măsuri de precauție BSL2. Toate lucrările cu aceste viruși trebuie efectuate într-un dulap de biosecuritate aprobat de tip II, iar orice echipament sau deșeuri solide potențial contaminate trebuie decontaminate cu o soluție de înălbitor de 10% sau prin autoclavare. După ce ați lucrat cu țesuturi sau soluții care pot fi contaminate cu CVB3, toate suprafețele trebuie curățate cu o soluție de înălbitor de 10%.

Tulpinile CVB3 pe care le folosim sunt agenți patogeni umani, care au fost izolați de indivizii care au suferit infecții CVB3. Acești viruși nu au fost adaptați la șoareci, dar provoacă o boală la șoareci similară cu cea observată la om (34). Din această cauză, cultivăm virusul în linii celulare de origine umană, în mod normal celule HeLa.

A. Creștere și izolare virală

b. Titrarea virală prin analiza plăcii

Folosim celule HeLa pentru a crește și a titra CVB3.

Calcule: (15 plăci)/(3 godeuri) * 4 = 20 PFU.

Deoarece plăcile au fost numărate pe diluția 10 -7, titrul viral este de 20 X 10 7 sau 2,0 X 10 8 PFU/mL.

model

Figura 1. Analiza plăcii. Placă reprezentativă pentru analiza plăcii. Puțurile au fost însămânțate cu celule HeLa la o densitate de 2 X 105/godeu și incubate peste noapte. A doua zi, celulele au fost infectate și suprapuse cu 0,5% agaroză/DMEM, așa cum este descris în text. Plăcile au fost incubate timp de două zile, celulele au fost fixate, suprapunerile de agaroză au fost îndepărtate și foaia de celule a fost colorată cu cristal violet. Au fost detectate 15 plăci la diluția de 10-7, prin urmare titrul probei virale a fost de 2 X 10 8/ml.

c. Infecția virală și generarea de pancreatită

Analiza histologică a țesutului pancreatic de la șoareci infectați cu CVB3 demonstrează o inflamație extinsă a pancreasului exocrin și necroză a celulelor acinare, în conformitate cu o clasificare a pancreatitei acute moderate la om, cu morbiditate ridicată fără mortalitate. Infiltratul inflamator este caracterizat în principal de monocite (celule T, celule B și celule ucigașe naturale) (27, 28). Deși s-a demonstrat că unele tulpini de coxsackievirus cauzează daune insulelor, marea majoritate a tulpinilor CVB provoacă daune extinse celulelor acinare, dar scutesc insulele și canalele (19, 45, 46), (37). Deși există unele controverse în ceea ce privește mecanismul prin care CVB provoacă leziuni ale țesutului pancreatic, se pare că afectarea observată în pancreata șoarecilor infectați cu coxsackievirus este rezultatul citolizei induse de virus, autodigestiei de către enzimele pancreatice și daunelor inflamatorii ale țesutului mediate de celule. (10, 19, 27, 28).

4. Discutie

Am stabilit un model preclinic relevant fiziologic de pancreatită acută. Acest model utilizează coxsackievirusuri izolate de la oameni care au suferit de infecție cu CVB3. Important, aceste virusuri nu sunt umanizate și recapitulează multe dintre modificările histologice observate în pancreatita acută umană (34).

Figura 2. Histologie pancreatică după infecția cu CVB3/CO a șoarecilor C57BK/6. Șoarecii au fost infectați cu 5 X 105 PFU/ml de CVB3/CO. Animalele au fost eutanasiate la momentele indicate după infecție și pancreata recoltată. Pancreasul a fost fixat, iar secțiunile colorate cu hematoxilină și eozină. A) animal neinfectat, B) la 2 zile după detectarea inflamației infecției, C) la 4 zile după infecție edemul, inflamarea și necroza celulelor acinare sunt evidente, D) 8 zile după infecție semnele de reparație sunt evidente cu prezența crescută a celulelor acinare și acini, E) 12 zile după infecție, o mare parte a leziunilor acute sunt rezolvate și mulți lobi ai pancreasului par normali, F) 14 zile după infecție este evidentă acumularea de grăsime intrapancreatică.

Acumularea de grăsime în pancreasul șoarecilor C57BL/6 infectați cu CVB3/CO poate fi un model util pentru boala pancreasului gras non-alcoolic (NAFPD). Recent, NAFPD a fost caracterizat și asociat cu funcția pancreatică diminuată și cu un risc crescut de diabet zaharat (22, 43). Un studiu transversal amplu a constatat că pancreasul gras a fost prezent la 35% dintre pacienții care se prezentau la un control medical, demonstrând prevalența acestuia (18).

Important, infecția cu CVB3, în mod normal, menține insulele pancreatice. Astfel, utilizarea acestui model permite studierea atât a tulburărilor exocrine, cât și a celor endocrine ale pancreasului în prezența unei grăsimi intrapancreatice crescute.

S-a demonstrat că virusurile Coxsackievirus stabilesc o infecție persistentă cu citopatologie diminuată în inima șoarecilor infectați experimental și a oamenilor infectați în mod natural, precum și în pancreata șoarecilor infectați (5, 15, 35). Astfel, este probabil ca CVB3 să poată persista și în pancreasul uman. Infecția persistentă a CVB3 a pancreasului poate avea un rol într-o serie de boli ale pancreasului. De exemplu, au fost raportate titruri crescute ale anticorpilor la coxsackievirus la pacienții cu pancreatită cronică (23). În schimb, este posibil ca infecția persistentă cu CVB3 să perpetueze un răspuns inflamator de nivel scăzut sau ca expresia continuă a proteinelor coxsackievirus să modifice funcțiile celulare importante. Prin urmare, este posibil ca infecția persistentă cu CVB3 să fie implicată în alte boli pancreatice, cum ar fi pancreatita autoimună și cancerul pancreatic (5). În plus, acumularea de grăsime în pancreasul șoarecilor C57BL/6 infectați cu CVB3/CO mult timp după rezolvarea infecției pancreatice acute ar putea fi posibil legată de infecția persistentă CVB3 a pancreasului.

În timp ce NAFPD a apărut recent ca un factor semnificativ în disfuncția pancreatică, abuzul de alcool a fost mult timp asociat atât cu pancreatita acută, cât și cu cea cronică. Abuzul de alcool este considerat etiologie în aproximativ 35% din cazurile de pancreatită acută la adulți (39). Se acceptă faptul că numai abuzul de alcool este insuficient pentru a incita pancreatita acută și, mai degrabă decât inițierea pancreatitei, alcoolul servește la sensibilizarea pancreasului la boala necro-inflamatorie (1, 24, 29, 44). Laboratorul nostru a combinat modelul pancreatitei acute indus de CVB3 cu administrarea de etanol la șoareci. Am constatat că administrarea de etanol exacerbează pancreatita indusă de CVB3 (8, 14, 30). De o importanță deosebită, utilizarea pancreatitei acute induse de CVB3 ca model pentru pancreatita acută alcoolică este relevantă din punct de vedere fiziologic pentru oameni, combinând administrarea de etanol cu ​​un factor declanșator care provoacă pancreatită acută la om.

5. Referințe