Abstract

fundal

Obezii diabetici de tip doi prezintă un risc crescut de fracturare a oaselor membrelor în comparație cu populația generală. S-a dovedit că fitoestrogenii, precum izoflavona din soia genisteină, protejează împotriva pierderii osoase. În acest studiu, am testat efectele tratamentului cu genisteină asupra femurilor șoarecilor ob/ob, un model pentru obezitate și diabet zaharat de tip doi.

Metode

Șoareci femele de douăzeci și șase de săptămâni au fost împărțite în grupuri obeze (ob/ob) de control, obeze tratate cu genisteină, slabe (ob/+) control și grupuri slabe tratate cu genisteinăn = 5 fiecare). Tratamentul cu genisteină a constat în 600 mg genisteină/kg dietă. Șoarecilor de control li s-a dat chow standard pentru rozătoare. La sfârșitul unei perioade de tratament de patru săptămâni, proprietățile histomorfometrice osoase și îndoirea în trei puncte au fost comparate între grupuri.

Rezultate

Șoarecii obezi aveau zone osoase mai mari (B.Ar.; P 0,05) a epifizei femurale proximale în comparație cu șoarecii slabi. Tratamentul cu genisteină a scăzut Tt.Ar. și lungimea femurului, și forța finală crescută necesară fracturării femurului și deformarea maximă până la eșec (P

fundal

Diabetul este o boală larg răspândită care afectează aproximativ 8,5% din populația Statelor Unite. Prezintă frecvent o varietate de complicații, inclusiv hipertensiune arterială, dislipidemie, infarct miocardic, accident vascular cerebral și insuficiență renală [1]. Obezitatea este un factor de risc pentru diabetul zaharat de tip 2 (T2DM), care este asociat cu un risc crescut de fracturi osoase ale membrelor, care durează mai mult timp pentru a se vindeca și sunt mai susceptibile de a duce la infecții și complicații [2-4]. Dovezi recente sugerează că T2DM reduce rezistența la încovoiere datorită redistribuirii ineficiente a masei osoase [5].

Leptina este un hormon secretat de țesutul adipos alb pentru a ajuta la reglarea obezității prin inducerea pierderii în greutate și a homeostaziei osoase. Deși obezitatea singură nu este legată de scăderea masei osoase [6], persoanele obeze cu T2DM prezintă adesea rezistență la leptină, care joacă probabil un rol în incidența crescută a fracturilor [7-10]. Șoarecele ob/ob are deficit de leptină din cauza unei mutații spontane a genei ob. Acest model de obezitate este un echivalent apropiat al condiției umane, rezultând hiperfagie, obezitate și un fenotip asemănător diabetului, inclusiv rezistența la insulină, hiperglicemia și scăderea masei osoase a membrelor. Ca model animal, șoarecele ob/ob este utilizat în mod obișnuit pentru a studia fenotipul T2DM și rezistența la leptină caracteristice obezității și T2DM, în special atunci când este asociat cu sindromul metabolic [11-15]. În timp ce sindromul metabolic singur nu este asociat cu un risc crescut de fractură, acesta se găsește împreună cu T2DM [13, 16, 17].

Obiectivul acestui studiu a fost de a evalua efectele tratamentului cu genisteină asupra structurii osoase femurale și a rezistenței la fractură la șoarecii femele ob/ob. Genisteina este un fitoestrogen care se găsește în soia și în alimentele pe bază de soia. Este similar din punct de vedere structural cu estrogenul și se poate lega de receptorii estrogeni cu afinitate mare [18, 19]. Fitoestrogenii precum genisteinul pot preveni reducerea pierderii osoase într-un mod similar cu terapia de substituție estrogenică la femeile aflate în postmenopauză, dar efectele sale depline în modelul obez de șoareci diabetici sunt necunoscute [19-24].

Metode

Proiectare experimentală

Douăzeci de șoareci obezi ob/ob și șoareci slabi ob/+ (B6.V-Lep/J, Laboratorul Jackson; Bar Harbor, ME, SUA) cu vârsta de șase săptămâni au fost folosiți în experiment. Șoarecii au fost ținuți într-o unitate pentru animale cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore și o temperatură de 22 ° C. Șoarecii au primit hrană și apă ad libitum. Aceste studii pe animale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Midwestern University și au urmat cu atenție Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator din National Institutes of Health.

La începutul experimentului, șoarecii au fost împărțiți în patru grupe de dimensiuni egale (n = 5), (1) șoareci slabi hrăniți cu o dietă standard, (2) șoareci slabi hrăniți cu o dietă genisteină, (3) șoareci obezi hrăniți cu o dietă standard și (4) șoareci obezi hrăniți cu o dietă genisteină. Dieta cu genisteină a fost formulată de Dyets Inc., (Bethlehem, PA, SUA) și a inclus 600 mg dieta de genisteină/kg administrată pentru perioada de studiu de 4 săptămâni. Această dietă este utilizată în mod obișnuit pentru a studia efectele fitoestrogenilor asupra stării T2DM la modelele de șoareci. Este comparabilă cu dietele pe bază de soia umană și s-a dovedit a avea efecte fiziologice semnificative cu patru săptămâni de tratament [22, 25-28].

Histomorfometria femurului

După sacrificiu, membrele posterioare ale fiecărui șoarece au fost îndepărtate. Femurele dreapta și stânga au fost recoltate și disecate curate de țesuturile moi. Un femur de la fiecare șoarece a fost pus deoparte pentru testarea îndoirii în trei puncte. Celălalt femur a fost utilizat pentru a efectua analize histomorfometrice ale epifizei și diafizei proximale. Aceste femuri au fost deshidratate în alcool de 70 și 85%, cu două modificări de 24 de ore în fiecare concentrație, eliminate cu Histoclear (National Diagnostics, Atlanta, Georgia, SUA) în două spălături de 24 de ore, infiltrate cu Osteo-Bed Resin A și catalizate Osteo- Bed Resin A (100 mL Osteo-Bed Resin A, 1,40 g Peroxid de benzoil) cu două modificări care durează 24 de ore, apoi încorporat în rășină (100 ml Osteo-Bed Resin A, 3,50 g Peroxid de benzoil; Polysciences Inc., Warrington, PA, STATELE UNITE ALE AMERICII). S-au adăugat șase ml de soluție de încorporare în flacoane care conțin femururi, care au fost acoperite și plasate într-o baie de margele la 33,5 ° C timp de 48 de ore pentru a polimeriza. Poziția și orientarea femurilor din flacoane au fost standardizate pentru a permite orientarea consecventă în timpul secționării.

După ce rășina s-a întărit, o singură secțiune a femurului proximal a fost luată în plan coronal și alta a fost preluată din diafiză în planul transversal distal față de al treilea trohanter folosind un ferăstrău cu viteză redusă (Isomet; Buehler, Lake Bluff, IL, SUA ). Secțiunile au fost tăiate la 200 μm grosime, lustruite (MetaServ; Buehler, Lake Bluff, IL, SUA) și colorate cu roșu de Alizarină (Sigma-Aldrich, Co., St Louis, MO, SUA). Secțiunile au fost apoi fotografiate la o mărire 40X cu un microscop Eclipse 55i (Nikon, Inc., Melville, NY, SUA). ImageJ v1.6 (NIH) a fost utilizat pentru a măsura suprafața totală (Tt.Ar.), zona osoasă (B.Ar.) și volumul osos (B.Ar./Tt.Ar.) Pentru fiecare epifiză proximală bazată pe Alizarin Colorarea roșie a țesutului osos. Pluginul MomentMacroJ (M Warfel și S Serafin) pentru ImageJ a fost utilizat pentru a calcula aria corticală (Ct.Ar), momentele secundare maxime și minime ale zonei (IMAX și IMIN) și momentul polar al zonei (J). Acestea sunt măsurători bazate pe teoria fasciculului ingineresc, care rezistă aproximativ la compresiune, îndoire și torsiune din geometria secțiunii transversale.

Test de îndoire în trei puncte a femurului

Un femur din fiecare specimen a fost supus unui test de îndoire în trei puncte până la eșecul evaluării rezistenței la fractură. Înainte de încărcare, lungimea fiecărui femur a fost măsurată până la cea mai apropiată sutime de milimetru folosind etriere digitale și locația arborelui mediu a fost marcată în creion. Forța a fost aplicată arborelui mediu în direcția anterioară-posterioară la 0,5 N/s folosind un vârf cu margine rotunjită (HP-5 cu suport de testare HSV; Handpi Instruments Co., Ltd, China). Femurele au fost ținute pe două suporturi care au fost poziționate pentru a contacta capetele proximale și distale ale osului. Distanța dintre suporturi nu a fost menținută constantă, deoarece lungimea femurului a variat mult în eșantionul nostru, iar măsurătorile proprietăților materialului osului sunt proporționale cu distanța dintre suporturi și diametrul osului în planul de rupere [29, 30]. Au fost înregistrate date despre forța finală, deplasarea maximă până la eșec și timpul până la eșec. A fost măsurată și localizarea fracturii exprimată ca procent din lungimea totală a femurului de-a lungul axei lungi.

analize statistice

Analiza statistică a fost finalizată utilizând software-ul SPSS 19 (IBM, SUA). Au fost utilizate teste de analiză bidirecțională a varianței (ANOVA) pentru a detecta diferențe semnificative între grupurile de tratament. Deoarece rezistența la fractura osoasă este proporțională cu lungimea și diametrul osului, ANOVA cu două căi a fost repetată cu lungimea și diametrul femurului ca covariabile [24]. Semnificația statistică a fost stabilită la P

Rezultate

Tratamentul cu genisteină a scăzut masa corporală

Șoarecii obezi aveau o masă corporală mai mare la începutul experimentului și în momentul sacrificării decât șoarecii slabi (P 0,05).

Tratamentul cu genisteină a scăzut aria totală a epifizei proximale a femurului, dar nu și volumul osos

Șoarecii obezi aveau zone osoase mai mari (B.Ar.) și suprafețe totale (Tt.Ar.) ale femurului proximal decât șoarecii slabiP 0,05, FIG. 1). Tratamentul cu genisteină a scăzut suprafața totală (P 0,05). Nu au fost găsite interacțiuni între genotip și tratament pentru aceste variabile histomorfometrice (P > 0,05).

rezistența

Comparația raporturilor dintre suprafața osoasă și suprafața totală (B.Ar./Tt.Ar.) A epifizei femurale proximale pentru șoarecii slabi și obezi hrăniți cu șobolan standard de rozătoare sau 600 mg genisteină/kg dietă. Nu s-a găsit niciun efect de genotip (ob/+ vs ob/ob) sau tratament (dieta standard vs dieta genisteină) cu analiza de varianță în două direcții (P > 0,05). Barele de eroare sunt 2 ± SE

Tratamentul cu genisteină nu a avut niciun efect asupra măsurătorilor histomorfometrice ale rezistenței osoase

Comparațiile dintre zona corticală (Ct.Ar.), momentele maxime și minime de inerție (IMAX, IMIN) și momentul polar al zonei (J) între șoarecii slabi și obezi nu au prezentat diferențeP > 0,05, Tabelul 1). Comparațiile acestor variabile între șoarecii hrăniți cu o dietă standard și cei tratați cu genisteină nu au arătat nici diferențe (P > 0,05). Nu s-au găsit interacțiuni de tratament genotip * pentru niciuna dintre variabile (P > 0,05).

Tratamentul cu genisteină a scăzut lungimea femurului

Femurele șoarecilor slabi au fost semnificativ mai lungi decât cele ale șoarecilor obezi (P 0,05).

Comparația lungimii femurului pentru șoarecii slabi și obezi hrăniți cu rozătoare standard sau 600 mg genisteină/kg dietă. Șoarecii tratați cu o dietă cu genisteină au avut femuri semnificativ mai scurți (P 0,05). Barele de eroare sunt 2 ± SE

Tratamentul cu genisteină a crescut cantitatea de forță necesară pentru fracturarea femurului

Rezultatele ANOVA bidirecțional pentru testul de îndoire în trei puncte sunt prezentate în Tabelul 2. Șoarecii tratați cu genisteină au avut femuri care au fost mai rezistenți la fracturi din sarcinile de îndoire la arborele mediu. Forța finală a fost semnificativ mai mare la șoarecii hrăniți cu genisteină decât șoarecii hrăniți cu chow standard (P 0.05), indicând o dietă cu genisteină, care afectează rezistența la fracturi în ambele genotipuri în mod similar. Când analiza a fost repetată cu lungimea femurului și diametrul mijlocului anterioară-posterioară ca covariabile, efectul principal semnificativ al tratamentului a rămas (F = 4,40; P Tabelul 2 Îndoirea în trei puncte a femurului Analiza de varianță în două direcții

Comparația încărcării finale pentru șoarecii slabi și obezi hrăniți cu șobolan standard de rozătoare sau 600 mg genisteină/kg dietă. Tratamentul cu genisteină a crescut semnificativ forța finală până la eșec la arborele mediu femural (P 0,05). Barele de eroare sunt 2 ± SE

Curbele de încărcare-deplasare derivate din rezultatele testului de îndoire în trei puncte. Testul a fost efectuat pe femele de șoareci slabi hrăniți cu o dietă standard (Lean STD), șoareci slabi hrăniți cu 600 mg genisteină/kg dietă (Lean + GEN), șoareci obezi hrăniți cu o dietă standard (Obese STD) și șoareci obezi hrăniți cu 600 mg genisteină/kg dietă (obezi + GEN)

Discuţie

Șoarecii ob/ob cu deficit de leptină sunt obezi și demonstrează un fenotip clinic relevant al T2DM [9]. Leptina este un hormon implicat în reglarea metabolismului și joacă un rol important în controlul aportului alimentar, precum și în dezvoltarea osoasă [7]. În consecință, lungimea osoasă a membrelor șoarecilor ob/ob este redusă în contrast cu șoarecii slabi [8, 23, 31]. Rezultatele experimentului nostru au fost în concordanță cu aceste rapoarte, deoarece am constatat că șoarecii ob/ob aveau femuri semnificativ mai scurți. În timp ce mecanismul precis care inhibă creșterea osoasă a membrelor longitudinale este necunoscut, s-a demonstrat că genisteina și alți fitoestrogeni afectează grosimea, calcificarea și proliferarea condrocitelor plăcilor de creștere a oaselor membrelor, așa cum se arată în studiile anterioare [22, 23, 32, 33] . Efectele tratamentului cu genisteină asupra lungimii osoase se pot datora efectelor sale inhibitoare asupra cartilajului plăcii de creștere. Sunt necesare investigații suplimentare pentru a elucida mecanismul.

Concluzii

Șoarecii tratați cu 600 mg genisteină/kg dietă prezintă o rezistență mai mare la fracturi în timpul testelor de îndoire în trei puncte, în comparație cu șoarecii de control hrăniți cu roză standard. Aceste date oferă sprijin pentru ipoteza că aportul de fitoestrogen îmbunătățește rezistența oaselor membrelor la fractură, nu numai la șoarecii slabi, ci și la șoarecii obezi care prezintă fenotipul T2DM. Cercetările viitoare trebuie să se concentreze pe markerii calității osoase pentru a determina modul în care genisteina afectează ultrastructura osoasă și proprietățile materialului.