Abstract

1. Introducere

Când rata de creștere a diferitelor trăsături variază ca răspuns la același gradient nutrițional, indivizii compuși din trăsături receptive diferențial vor crește nu doar la dimensiuni corporale diferite, ci vor dezvolta, de asemenea, diferite forme. Acest lucru face ca studiul creșterii dependente de nutriție să fie esențial pentru înțelegerea noastră asupra reglării dezvoltării și diversificării evolutive a formei. Răspunsurile plastice la nutriție și efectele lor asupra scalării și formei pot fi investigate prin studiul alometriilor statice. Alometriile statice permit evaluări cantitative ale dimensiunilor organelor în raport cu dimensiunile corpului la indivizi din aceeași populație [11], iar numeroase studii ilustrează acum modul în care diferențierea diferențială a trăsăturilor din specii și schimbările evolutive în relațiile de redimensionare dintre specii au jucat roluri critice în geneză. de diversitate morfologică (de ex. aripi de insecte [12] și coarne de gândac [13]). Ceea ce este mai puțin bine înțeles, totuși, sunt mecanismele de dezvoltare care reglează răspunsurile de creștere precise, specifice organelor de-a lungul gradienților nutriționali: cum reglează organismele răspunsurile extreme de creștere ale unor trăsături, protejându-le pe altele de fluctuațiile de mediu?

Onthophagus taurus este un gândac comunitar în Marea Mediterană și introdus secundar în America de Nord și Australia. Masculii acestei specii se dezvoltă, așa cum este obișnuit pentru mulți membri ai acestui gen, în două morfe alternative, în funcție de nutriția larvelor: nutriția larvelor ridicate are ca rezultat dezvoltarea unor coarne mari, cu coarne., major masculii care se bazează pe un comportament agresiv de luptă pentru a asigura femelele, în timp ce condițiile nutriționale scăzute duc la dezvoltarea de mici, fără corn, minor bărbații care se bazează pe comportamente furtive neagresive și pe competiția spermei pentru a asigura oportunități de împerechere. Alometria rezultată a lungimii cornului - dimensiunea corpului este puternic sigmoidală, iar morfele fără corn și corn sunt separate printr-un prag ascuțit al dimensiunii corpului. Morfologiile intermediare există în populațiile naturale, dar sunt comparativ extrem de rare [20].

Studii recente efectuate în acest sistem au arătat că cel puțin două căi sunt regulatori critici ai dimensiunii corpului și al formării coarnelor dependente de nutriție. Doublesex (Dsx), membrul cardinal al căii somatice de determinare a sexului, promovează creșterea cornului la bărbații mari, cu nutriție ridicată [21] și dsx ARNi elimină creșterea cornului care răspunde nutriției la bărbații mari. Prin contrast, calea de semnalizare Hedgehog (Hh), cea mai larg studiată pentru rolul său în modelarea polarității anterioare/posterioare, inhibă în mod activ creșterea cornului la bărbații mici, cu nutriție scăzută și eliminarea netezit (noi suntem), un activator cheie al semnalizării Hh, induce coarne în larvele masculine altfel destinate să se dezvolte în bărbați minori fără corn [22]. Combinate, aceste studii au demonstrat că atât semnalizarea Dsx, cât și Hh sunt critice pentru inducerea specifică a dimensiunii corpului sau, respectiv, pentru reprimarea coarnelor, și pentru formarea corectă a dimensiunii corpului prag care separă morfii masculi alternativi. in orice caz, Cum acțiunea oricărei căi este coordonată în lumina stării nutriționale a unui individ dat rămâne neclară. Mai exact, dacă semnalizarea Dsx sau Hh (sau ambele) sunt legate de componentele semnalizării IIS și, prin urmare, nutriția nu a fost încă examinată.

În acest studiu, ne-am concentrat asupra celor două paralogii ale receptorilor de insulină, comune celor mai multe insecte, InR1 și InR2, precum și Foxo, pentru a evalua funcțiile posibile ale diverselor membri ai căii IIS în reglarea sensibilității și robusteții nutriționale. Am comparat dezvoltarea coarnelor, o trăsătură extrem de sensibilă la nutriție, cu cea a organelor genitale masculine (în mod specific, aedeagus), o trăsătură insensibilă la nutriție. Mai mult, am testat dacă semnalizarea IIS ar putea acționa în amonte de semnalizarea Dsx sau Hh sau ambele, oferind astfel una sau ambele căi cu informații cu privire la condițiile nutriționale predominante în timpul dezvoltării gândacului.

2. Material și metode

(a) Creșterea gândacilor

Onthophagus taurus gândacii au fost colectați lângă Bloomington, IN și Chapel Hill, NC, și crescuți și întreținuți în coloniile de laborator, așa cum s-a descris anterior [23].

(b) Foxo, InR1 și InR2 clonarea și eliminarea RNAi

Grundele au fost concepute împotriva O. taurus Foxo, InR1 și InR2, iar fragmentele corespunzătoare au fost clonate și secvențiate pentru a verifica identitatea. ARN dublu catenar (dsARN) pentru injecții cu ARNi a fost generat așa cum s-a descris anterior [21]. ARNs de control a fost generat urmând aceeași procedură utilizând o secvență vectorială. Au fost utilizate următoarele concentrații de dsARN (dizolvate în tampon de injecție): injecții martor și Foxo ARNi (1 μg de dsARN); InR1 ARNi (0,5, 1, 3, 6 sau 9 μg); InR2 ARNi (0,25, 1 μg) și InR1+2 ARNi (0,5 ug). Concentrațiile au fost variate în unele cazuri, în încercarea de a îmbunătăți penetrarea și de a reduce mortalitatea. Toate injecțiile au fost executate în timpul ultimului (= al treilea) stadiu larvar.

(c) Reacție în lanț cantitativă în timp real a polimerazei

(d) Măsurători și analize alometrice

3. Rezultate

(A) Foxo ARNi liniază dimensiunea corpului sigmoidal - alometria mărimii cornului

Reamintim că dezvoltarea cornului la mascul O. taur este extrem de sensibil la nutriție, rezultând în formarea a două morf alternative cu coarne și fără corn, separate printr-un prag de dimensiune corporală clar definit. Pentru a investiga rolul Foxo în acest polifenism masculin nutrițional, am folosit epuizarea transcripției mediate de interferență ARN Foxo urmată de evaluări morfometrice ale lungimii cornului în raport cu mărimea corpului. Foxo ARNi a modificat profund această relație de scalare în mod normal puternic sigmoidală, inducând coarne relativ mai lungi la bărbații mici, cu nutriție redusă, în timp ce simultan reducea modest lungimea cornului la câțiva bărbați mari, cu nutriție ridicată, în comparație cu indivizii controlați (figura 1A,b). Montarea modelelor alometrice (sigmoidale) la Foxo ARNi și indivizii injectați de control au relevat o diferență semnificativă în trei dintre parametrii analizați: o reducere a amplitudinii (p = 0,014), o trecere a punctului de inflexiune la dimensiuni mai mari ale corpului (p = 0,019) și o înălțime a y-interceptare (p

medierea

Figura 1. Efectul Foxo ARNi pe relația de scalare sigmoidală extrem de sensibilă la nutriție între dimensiunea corpului și lungimea cornului. Foxo ARNi a indus creșterea cornului la o nutriție slabă, în mod normal bărbați fără corn (A,b), în timp ce reducerea modestă a creșterii cornului în unele nutriții bogate, bărbații în mod normal cu corn completb,c). Compararea indivizilor injectați de control (gri) și indivizi (roșu) folosind ecuații Hill cu patru parametri montate independent, urmate de cele ale lui Welch t-testele pentru a compara estimările parametrilor au relevat o diferență semnificativă în amplitudine, punct de inflexiune, y-interceptare, dar nu panta. Comparând AIC și R 2 valori între modelele sigmoidale și liniare pentru ambele grupuri de tratament au evidențiat o diferență majoră de potrivire pentru indivizii controlați, indicând faptul că un model sigmoid surprinde cel mai exact relația de scalare între dimensiunea corpului și lungimea cornului. Prin contrast, potrivirea unui model sigmoid la Foxo Indivizii RNAi îmbunătățesc modest doar potrivirea în comparație cu o regresie liniară simplă, sugerând că Foxo ARNi transformă parțial alometria dimensiunii corpului - lungimea cornului de la puternic sigmoidal către o relație mai liniară. (Versiune online color.)

Pentru a evalua în continuare ipoteza că Foxo ARNi liniază dimensiunea corpului în mod normal sigmoidal - alometria lungimii cornului, am montat fie un model sigmoidal, fie un model liniar la fiecare dintre grupurile noastre de tratament și am examinat ambele R 2 și valorile AIC. Cum era de așteptat, R 2 valori sunt maximizate la animalele injectate cu control atunci când se aplică un model sigmoid (R 2, sigmoid = 0,943, R 2, liniar = 0,671); cu toate acestea, această discrepanță de potrivire scade în Foxo RNAi masculi (R 2, sigmoid = 0,884, R 2, liniar = 0,759). În mod similar, valorile AIC indică o potrivire superioară a modelului sigmoid la indivizii injectați de control (sigmoid AIC = 33,73, AIC liniar = 115,25), dar arată că această discrepanță scade în Foxo Bărbații RNAi datorită atât reducerii potrivirii modelului sigmoidal (sigmoid AIC = 61,19), cât și creșterii proporționale a potrivirii modelului liniar (AIC liniar = 95,15). Combinate, aceste rezultate susțin ipoteza că Foxo ARNi reduce semnificativ natura sigmoidală a dimensiunii corpului - alometria lungimii cornului, transformându-l în schimb într-o relație de scalare mai liniară.

(b) InR ARNi nu are niciun efect asupra dimensiunii corpului - alometria mărimii cornului

(c) Foxo reglează sensibilitatea nutrițională, în timp ce InR reglează dimensiunea generală a organelor genitale

Apoi, am investigat dacă semnalizarea insulinei poate juca, de asemenea, un rol în reglarea insensibilității nutriționale, adică tamponarea creșterii în fața variației nutriționale. Pentru a face acest lucru, ne-am concentrat asupra dezvoltării organelor genitale masculine, în special aedeagus, o structură a cărei dimensiune absolută se schimbă doar modest în funcție de nutriția larvelor. Mai exact, am măsurat lungimea edeagului în controlul injectat, Foxo ARNi, InR1 ARNi, InR2 RNAi și InR1+2 Indivizi ARNi. Rezultatele noastre sugerează că Foxo ARNi a modificat semnificativ relația de mărire a corpului - aedeagus (t = 4.011, p = 0,0001) rezultând un alt scădea al pantei organelor genitale - alometria dimensiunii corpului (t = −4,122, p ARNi a dus la o reducere a dimensiunii edeagului în raport cu mărimea corpului toate dimensiunile corpului (t = −4.502, p ARNi (figura 2c; material suplimentar electronic, tabelul S3) și InR1+2 ARNi (figura 2d; material electronic suplimentar, tabelul S3; InR2tratament: t = −2,574, p = 0,0123; InR2marimea corpului: t = 13. 284, p

Figura 2. Efectele Foxo ARNi, InR1 ARNi, InR2 RNAi și InR1+2 ARNi pe relația de scalare în mare parte nutrițională-insensibilă între dimensiunea corpului și lungimea organelor genitale masculine. Afișați sunt indivizi injectați de control (gri) și derivați (roșii). (A) Foxo ARNi a dus la o scădere semnificativă a pantei alometriei dimensiunii corpului - organelor genitale, în timp ce (b) InR1 ARNi, (c) InR2 RNAi și (d) InR1+2 ARNi a redus semnificativ dimensiunea organelor genitale la toate dimensiunile corpului. Aceleași persoane de control sunt afișate pe toate cele patru panouri. (Versiune online color.)

(d) dsx și noi suntem nivelurile de expresie pot fi reglate de calea de semnalizare a insulinei

Figura 3. Larva dsx și noi suntem nivelurile de expresie la indivizii controlați și următorii Foxo ARNi, InR1 ARNi, InR2 RNAi și InR1+2 ARNi. (A) qRT-PCR folosind larve ale întregului corp arată că dsx nivelurile de expresie nu sunt afectate de Foxo RNAi sau InR1 ARNi, dar redus semnificativ în urma InR2 ARNi și în mod semnificativ reduse în mod semnificativ InR1+2 ARNi. Acest lucru sugerează că InR2, dar nu InR1, promovează dsx expresie la indivizi de tip sălbatic. (b) noi suntem nivelurile de expresie sunt semnificativ reduse după Foxo RNAi, dar neafectat de InR1 ARNi, InR2 RNAi și InR1+2 RNAi, sugerând că Foxo promovează noi suntem expresie la indivizi de tip sălbatic. Graficele de cutii prezintă 25% și 75% quartile (cutii), medianele (liniile care împart casetele), valorile exterioare (mustăți), valorile exterioare (puncte) și punctele de date (punctele care se suprapun cu casetele și mustățile). *p • p

O abordare similară în etapa pupală a dat, în parte, rezultate izbitor de diferite. In timp ce Foxo ARNi nu a afectat dsx expresie la 24 de ore după injectarea larvelor, în pupele rezultate dsx expresia a prezentat o creștere cu 34% (material suplimentar electronic, figura S6a). În mod similar, pupal noi suntem expresia a crescut în urma ambelor Foxo RNAi și InR1 ARNi, în timp ce larvele au prezentat o scădere sau nicio modificare a expresiei, respectiv (material suplimentar electronic, figura S6b). Aceste rezultate sugerează că natura interacțiunilor dintre dsx, suntem și membrii IIS pot varia de-a lungul dezvoltării și/sau că etapele de dezvoltare ulterioare pot fi afectate prin ajustări compensatorii în dinamica expresiei ca urmare a perturbațiilor ARNi. Mai general, aceste rezultate ridică posibilitatea ca IIS să ofere informații nutriționale critice pentru acțiunea ulterioară dependentă de nutriție a regulatorilor de creștere specifici părții corpului.

4. Discutie

(A) FoxoRolul său în dezvoltarea și evoluția cornei sigmoidale - scalarea mărimii corpului

(b) Foxo reglează atât plasticitatea, cât și robustețea într-o manieră specifică țesutului

(c) InR reglează edeagul dar nu creșterea cornului

Rezultatele noastre sugerează, de asemenea, posibilitatea interacțiunilor de dezvoltare între InR și hormoni de năpârlire, așa cum este indicat de fenotipul de nămol detectat după doze mari InR1/ 2 injecții cu ARNi observate mai devreme. Studiile anterioare efectuate pe insecte au documentat interacțiunile dintre IIS și doi hormoni principali de năpârlire, ecdizonul și hormonul juvenil (JH; [38,39]). Interesant este că ecdysone a fost implicat și în reglementarea Drosophila creșterea imaginală a discului [40], iar JH contribuie la reglarea creșterii sensibile la nutriție în mandibulele gândacului de cerb [41]. Sunt necesare studii comparative între taxoni și căi pentru a dezlega în continuare căile de dezvoltare și evoluție către plasticitatea nutrițională diferențiată între tipurile de trăsături.

(d) Calea de semnalizare insulină/asemănătoare insulinei interacționează cu ambele dsx și noi suntem pentru a regla creșterea sensibilă la nutriție

Dimpotrivă, găsim și asta InR2 ARNi (dar nu Foxo ARNi sau InR1 ARNi) are ca rezultat o reducere a dsx dar nu noi suntem, în concordanță cu rolul unuia dintre paralogii receptorilor de insulină în promovarea dsx expresie și, prin urmare, creșterea cornului. Spre deosebire de a noastră Foxo Cu toate acestea, rezultatele ARNi, InR2 RNAi o face nu fenocopie dsx Fenotipuri de corn ARNi, ceea ce face ca aceste constatări să aibă nevoie de studii suplimentare. În mod colectiv, rezultatele noastre oferă astfel dovezi importante, susținând că semnalizarea IIS poate furniza informații nutriționale esențiale căilor Hh (prin Foxo) și posibile căi Dsx (prin InR2) care apoi transduc aceste informații pentru a instrui răspunsurile de creștere specifice organelor (figura 4).

În concluzie, rezultatele noastre sugerează că în gândacul corn-polifenic O. taur, atât sensibilitatea nutrițională, cât și insensibilitatea pot fi reglementate de diverse componente ale căii IIS și de interacțiunile lor cu dsx și Hh semnalizare prin diferite părți ale corpului. Numărul tot mai mare de studii care implică diverse componente IIS atât la insecte hemi-, cât și la insecte holometabolice susține ipoteza că această cale poate fi un punct fierbinte pentru evoluția creșterii trăsăturilor sensibile la nutrienți [5,18,19], inclusiv, așa cum sugerează rezultatele din acest studiu, tranziția evolutivă de la alometriile liniare la cele puternic sigmoidale. Cu toate acestea, componentele specifice IIS și interacțiunile lor cu alte căi (de exemplu, TOR, Hippo, Dsx și Hh) vor necesita investigații suplimentare pentru a dezlega căile de dezvoltare și evoluție către plasticitatea nutrițională diferențiată între tipurile de trăsături din diferite linii.

Etică

Toate procedurile la animale au aderat la liniile directoare ABS pentru utilizarea animalelor în cercetare. Animalele au fost ținute în cele mai bune condiții posibile pe baza biologiei acestei specii. Studiul a implicat o specie comună de insecte pentru care nu a fost necesară o revizuire de către un organism de reglementare instituțional sau guvernamental.