Editat de Clifford J. Tabin, Harvard Medical School, Boston, MA și aprobat pe 21 decembrie 2018 (primit pentru examinare 27 octombrie 2018)

convergente

Semnificaţie

Mamiferele s-au adaptat în mod repetat la dietele specializate, inclusiv dietele pe bază de plante pentru erbivore și dietele pe bază de carne sau insecte pentru carnivore. În afară de consumul de diete cu diferite compoziții nutritive, erbivorele obligatorii și carnivorele diferă în alte aspecte, cum ar fi timpul petrecut în hrănire, regularitatea secreției de suc pancreatic, expunerea la compuși toxici din plante și diversitatea microbiomului intestinal. Pentru a înțelege mai bine cum au evoluat modificările legate de dietă, am efectuat ecrane la nivelul genomului pentru pierderile de gene convergente care au apărut preferențial la erbivore sau la carnivore. Am descoperit pierderi repetate de gene implicate în digestia grăsimilor, secreția sucului pancreatic, homeostazia glucozei, reglarea apetitului, detoxifiere și diversitatea microbiomului intestinal. Rezultatele noastre relevă modificări genomice asociate specializării dietetice și luminează modificările metabolice și fiziologice la mamiferele erbivore și carnivore.

Abstract

Adaptările la diferite surse de alimente au dus la specializări dietetice repetate, care constituie o piatră de temelie a ecologiei mamiferelor. În timp ce compoziția dietetică exactă este probabil unică pentru fiecare descendență, mamiferele placentare pot fi clasificate pe scară largă în erbivore, omnivore și carnivore. Specializarea dietetică este asociată cu o varietate de trăsături. Pentru a digera materialul vegetal, erbivorele posedă adesea un tract gastrointestinal mărit, ceea ce crește timpul de retenție a alimentelor și facilitează fermentarea de către comunități bacteriene specializate din intestin (1). Specializarea dietetică este asociată cu diferențe de nivel și activitate ale enzimelor și transportorilor intestinali (2). O dietă erbivoră sau carnivoră este, de asemenea, un factor major care influențează compoziția și diversitatea microbiomului intestinal (3).

Pentru a detecta în mod sistematic modificările genomice care sunt asociate cu o dietă erbivoră obligatorie sau carnivoră obligatorie, am efectuat un ecran imparțial pentru pierderile de gene convergente care sunt asociate cu astfel de specializări dietetice la 31 de mamifere placentare. Ecranul nostru a descoperit o serie de pierderi de gene necunoscute anterior la erbivore și carnivore care luminează diferențele legate de compoziția dietetică, tiparele de hrănire și microbiomii intestinali.

Rezultate

Clasificarea mamiferelor în descendențe independente de erbivore și carnivore.

Pentru a identifica pierderile de gene convergente asociate cu specializarea dietetică în erbivore și carnivore, am clasificat mamiferele placentare cu un genom secvențiat în 16 erbivore obligatorii și 15 carnivori obligați (Fig. 1 și Dataset S1). Omnivorii au fost excluși din analiză. Mamiferele insectivore obligatorii au fost incluse în grupul carnivorelor. Folosind o definiție destul de strictă de erbivor și carnivor, am obținut șase descendențe independente de erbivore și cinci descendențe independente de carnivore (Fig. 1).

Prezentare generală a pierderilor de gene convergente la mamiferele erbivore sau carnivore. O dietă strictă erbivoră sau carnivoră a evoluat de mai multe ori independent la mamifere. Cele șase descendențe erbivore și cinci carnivore sunt indicate prin fundaluri roșii și, respectiv, albastre. Speciile cu caractere aldine au fost incluse în ecranul inițial la nivelul întregului genom; speciile cu font gri închis au fost inspectate manual pentru prezența mutațiilor comune care nu activează genele. Modelele de pierdere ale genelor legate de dietă care se pierd preferențial fie în erbivore, fie în carnivore sunt prezentate prin cruci roșii. Pierderile genetice care au avut loc deja la strămoșul speciilor înrudite, deduse din mutații inactivante comune, sunt indicate de căsuțe roșii. Siluetele de animale au fost descărcate de pe phylopic.org/ și sunt oferite de Steven Traver, David Orr, Oscar Sanisidro, Yan Wong și Michael Keesey.

Identificarea sistematică a pierderilor de gene convergente la erbivore și carnivore.

Am efectuat un ecran sistematic pentru gene care codifică proteinele, care sunt preferențial pierdute, fie în linii erbivore independente, fie în linii independente de carnivore. În acest scop, am folosit datele despre pierderea genelor generate de o abordare de calcul care detectează cu precizie mutațiile care inactivează genele care codifică proteinele pe baza alinierilor genomului (9, 10). Mai exact, această abordare analizează codonii de oprire prematură, mutațiile care împiedică site-ul de îmbinare, inserțiile și delețiile de schimbare a cadrelor și ștergerea exonilor întregi sau chiar a genelor întregi. Toți pașii pe care i-am efectuat pentru identificarea și validarea pierderilor genetice sunt prezentate în apendicele SI, fig. S1.

Pentru a detecta în mod robust pierderile de gene convergente la erbivore, am cerut ca o genă să fie pierdută în cel puțin trei linii independente de erbivore. În plus, am cerut ca gena să prezinte un cadru de citire intact în cel puțin 80% din toate carnivorele. O abordare analogă a fost aplicată pentru a identifica pierderile de gene convergente la carnivore. Aceste ecrane au identificat 37 de gene care se pierd preferențial în erbivore și 44 de gene care se pierd preferențial în carnivore (seturile de date S2 și S3).

Servind drept controale pozitive, ecranul nostru a detectat pierderea convergentă a carnivorului a două gene ale receptorilor de gust, TAS1R1 și TAS1R2, și gena markerului gustului acru, PKD2L1, care au fost anterior legate de mamifere cu o dietă carnivoră (6, 7). De asemenea, am confirmat și extins constatările anterioare că UGT1A6, o genă care codifică o enzimă metabolizantă xenobiotică, se pierde la pisică, focă Weddell și morsă (11, 12) (Anexa SI, Fig. S2 și Dataset S4). Cu toate acestea, UGT1A6 nu se pierde în alte linii de carnivore independente; prin urmare, nu a îndeplinit criteriul nostru de a fi pierdut în cel puțin trei descendențe independente. În afară de detectarea câtorva pierderi de gene cunoscute, majoritatea celor 37 și 44 de pierderi de gene convergente nu au fost descrise anterior.

Identificarea pierderilor genei convergente legate de specializările dietetice.

Pentru a explora care dintre cele 37 de gene asociate cu erbivore și 44 de carnivore au funcții legate de dietă, am investigat dacă aceste gene sunt îmbogățite pentru anumiți termeni ai ontologiei genetice (GO). Deși nu am identificat îmbogățiri semnificative după ce am corectat testele multiple, termenii GO de top au indicat asociații potențial legate de dietă (seturile de date S5 și S6). Pentru pierderile de gene asociate erbivorilor, acești termeni GO includ „exocitoză” [SYCN (sincolină), MIA3]. Pentru pierderile de gene asociate carnivorilor, termenii GO de top includ „reglarea pozitivă a comportamentului de hrănire” [RXFP4 (peptida familiei relaxinei/receptorul INSL5 4), INSL5 (insulină ca 5)], „activitatea receptorului gustului” (TAS1R1, TAS1R2) și „secreția de acid arahidonic” (PLA2G2C, PLA2G2A).

Important, nu fiecare genă care se pierde preferențial fie la erbivore, fie la carnivore are o funcție evidentă legată de dietă. Acest lucru este exemplificat de PLCZ1, gena de top clasificată identificată în ecranul erbivorilor (Dataset S2), care este implicată în activarea ovocitelor (13). Prin urmare, pentru a evalua care dintre genele pierdute au funcții legate de dietă, am efectuat o căutare literară pentru cele două seturi de 20 de gene de top. Această căutare a relevat șase gene cu funcții relevante pentru specializarea dietetică: PNLIPRP1 (proteina 1 legată de lipaza pancreatică) și SYCN, care au funcții diferite în pancreas și se pierd preferențial în erbivore; și INSL5, RXFP4, NR1I3 (subfamilia receptorului nuclear 1 grupa I membru 3) și NOX1 (NADPH oxidază 1), care sunt implicate în reglarea aportului alimentar, homeostaziei glucozei, detoxifierii xenobiotice și imunității înnăscute și se pierd preferențial în carnivore (Fig. 1).

Niciuna dintre aceste șase pierderi de gene nu a fost descrisă anterior la aceste specii. Exemple de mutații inactivante în fiecare dintre aceste gene sunt prezentate în Fig. 2. Toate mutațiile inactivante la toate speciile de pierdere de gene și suprapunerea acestora cu domeniile proteice funcționale sunt furnizate în apendicele SI, fig. S3 - S8. Procentul cadrului de citire care rămâne intact, care contrastează modelul pierderii genei versus conservarea genelor între ierbivore și carnivore, este prezentat în Fig. 3.

Exemple de mutații inactivante la gene care se pierd preferențial la erbivore (A și B) sau carnivore (C - F). Structura exon - intron de codificare a fiecărei gene legate de dietă este prezentată în partea de sus. Din considerente legate de spațiu, Insetele prezintă o singură mutație reprezentativă inactivatoare pentru o singură descendență de genă, distingând erbivorele prin font albastru și carnivorele prin font roșu. Cutiile negre și gri indică nucleotidele care aparțin aceluiași codon. Toate mutațiile inactivante din aceste gene sunt validate prin citirea secvențială ADN brut și sunt prezentate în apendicele SI, fig. S3 - S8.

A doua genă pancreatică, PNLIPRP1, se pierde în opt descendențe erbivore, dar numai în două descendențe carnivore (cachalota și balenele minke/bowhead, discutate mai jos) (Fig. 1). În special, în timp ce PNLIPRP1 la cal nu prezintă mutații inactivante, această genă specifică pancreasului nu mai este exprimată în pancreasul cailor (22).

Pierderea aportului de alimente și a genelor care reglează homeostazia glucozei la carnivore.

În al doilea rând, pe lângă reglarea poftei de mâncare, INSL5 și RXFP4 au fost, de asemenea, legate de homeostazia glucozei. Studiile pe linie celulară și șoareci au arătat că activarea RXFP4 de către INSL5 joacă un rol de reglementare în secreția de insulină stimulată de glucoză în celulele β pancreatice, care exprimă RXFP4 (32 ⇓ –34). Mai mult, hormonul INSL5 reglează producția de glucoză (gluconeogeneză) în ficat (35). Astfel, pierderea repetată a ambelor gene în carnivore poate fi în plus legată de conținutul mai scăzut de carbohidrați din dieta lor. Pentru a menține un nivel suficient de glucoză, carnivorele precum pisicile și nurcile prezintă o gluconeogeneză constantă (36, 37). Astfel, modificările metabolismului glucozei carnivorelor ar fi putut face ca nevoia de reglare a homeostaziei glucozei mediată de INSL5 - RXFP4 să fie învechită. Interesant, deoarece gluconeogeneza este chiar activă la pisici și nurci după hrănire, unde insulina este de așteptat în mod normal să suprime gluconeogeneza (36, 37), este posibil să existe o legătură directă între pierderea hormonului INSL5 reglat prin hrănire care afectează insulina. secreția și prezența gluconeogenezei constante. Pe scurt, pierderea INSL5 și RXFP4 la carnivore poate fi legată atât de tiparele de hrănire neregulate, cât și de gluconeogeneza constantă.

Pierderea genei de imunitate înnăscută NOX1 în carnivore.

Carnivorele și erbivorele nu se confruntă doar cu provocări diferite legate de digestie și metabolism, ci și găzduiesc bacterii diferite în intestin (3). În plus, carnivorul este în general asociat cu microbiomi intestinali mai puțin diferiți decât ierbivorii (3). Aceste diferențe ale microbiomului intestinal pot fi reflectate prin modificări ale sistemului imunitar înnăscut, care la rândul lor pot influența și compoziția microbiomului intestinal (38). Ecranul nostru genomic a detectat pierderea genei imune înnăscute NOX1 în patru linii de carnivori (Fig. 1).

NOX1 codifică o proteină transmembranară care este extrem de exprimată în epiteliul de colon (39). Ca și alte NADPH oxidaze, NOX1 facilitează generarea de specii reactive de oxigen (ROS) (39), iar această activitate a fost legată de apărarea imună antimicrobiană și restituirea mucoasei colonului (stratul cel mai intern al celulelor din colon care este expus intestinului microbiom). Susținând o funcție în răspunsul imun antimicrobian, producția de ROS de NOX1 poate fi indusă de lipopolizaharide bacteriene și flagelină sau de citokine ale sistemului imunitar, cum ar fi IFN-γ (40 ⇓ –42). Șoarecii knock-out NOX1 au relevat în continuare o funcție a NOX1 în vindecarea rănilor și restituirea mucoasei colonului (43, 44). Funcțiile de apărare antimicrobiană și restituire a mucoasei NOX1 sunt probabil legate. Bacteriile patogene pot deteriora mucoasa colonului, care provoacă inflamații. Răspunsul inflamator ar declanșa apoi generarea ROS de NOX1 pentru a ucide bacteriile patogene și a activa căile de vindecare a rănilor. Prin urmare, NOX1 joacă roluri importante la intersecția dintre gazdă și microbiomul său.

Pierderea NOX1 ar putea fi legată de diferențele dintre microbiomii intestinali erbivori și carnivori. De exemplu, carnivorele posedă de obicei jumătate din diversitatea speciilor bacteriene decât erbivorele (3). Expunerea la comunități bacteriene mai puțin diverse din intestinul carnivorului ar fi putut duce la o presiune redusă de selecție pentru a păstra NOX1 în carnivore.

Pierderea genelor de detoxifiere la carnivore.

Mamiferele erbivore posedă o varietate de receptori și enzime pentru a face față xenobioticelor potențial toxice, derivate din plante, în dieta lor (45). Deoarece o dietă carnivoră nu oferă cantități mari de xenobiotice derivate din plante, genele de detoxifiere sunt mai puțin importante pentru carnivore. Ecranul nostru genomic a detectat pierderea convergentă a NR1I3 în trei linii de carnivori independenți (Fig. 1). NR1I3 codifică unul dintre principalii receptori xenobiotici. Interesant este faptul că, deși nu îndeplinește criteriile noastre stricte de screening, gena NR1I2 funcțională este, de asemenea, pierdută în două linii de carnivore (cetacee și musara) (Anexa SI, Fig. S17 și Dataset S4). NR1I3 și NR1I2 sunt exprimate în principal în ficat și intestin și activează un număr mare de citocrom P450 și alte enzime de metabolizare xenobiotică, inclusiv UGT1A6 (46). Similar cu NR1I3, resturile de NR1I2 nu sunt exprimate în ficatul cetaceelor ​​(Anexa SI, Fig. S18). Pierderea NR1I3 și NR1I2 sugerează că componentele cheie ale căii xenobiotice hepatice și intestinale se pierd în mai multe carnivore, ceea ce ar putea fi legat de o expunere mai mică la xenobiotice derivate din plante într-o dietă carnivoră.

Discuţie

În concluzie, pierderile de gene convergente oferă noi perspective asupra unei întrebări ecologice clasice dintr-o perspectivă moleculară. Mai general, studiul nostru evidențiază modul în care genomica comparativă poate arunca lumina asupra proceselor biologice care s-au schimbat în erbivore obligatorii sau carnivore, ceea ce extinde înțelegerea noastră despre modul în care specializările dietetice similare au evoluat în mod repetat la mamiferele placentare.

Materiale și metode

Descrieri detaliate ale îmbogățirii GO, ratei de selecție și analizelor datelor de expresie sunt furnizate în anexa SI.

Detectarea evenimentelor de pierdere genică.

Am folosit o conductă dezvoltată anterior pentru a detecta sistematic mutațiile care inactivează genele (9). Pentru a depăși problemele de asamblare și aliniere și pentru a aborda modificările evolutive ale structurii exon-intron, această conductă: (i) distinge golurile de asamblare de ștergerile reale (55), (ii) realiniază exonii de codificare cu CESAR pentru a lua în considerare citirea cadrului și a informațiilor despre site-ul de îmbinare 57), (iii) exclude aliniamentele paralogice sau pseudogene procesate și (iv) ia în considerare toate izoformele APPRIS principale sau alternative ale unei gene (58). Ca input, am folosit o aliniere a genomului întreg între ansamblul genomului hg38 uman (referință) și ansamblurile genomului altor mamifere placentare (interogare) (10) și adnotarea genei umane Ensembl v90 (59). Am exclus receptorii olfactivi a căror relație cu specializările dietetice au fost cercetate anterior (60) și, prin urmare, au considerat un total de 16.155 gene.

Am folosit pozițiile mutațiilor inactivante pentru a calcula procentul maxim al cadrului de citire care rămâne intact (% intact). De exemplu, un cadru de citire intact de 90% poate apărea printr-o mutație inactivantă care este aproape de capătul N sau C. Având în vedere că genele conservate pot avea mutații inactivante apropiate de capătul N sau C terminal (56), am considerat genele cu% intact ≥ 90% ca fiind conservate. Genele cu% intacte ≤ 60% au una sau mai multe mutații la mijloc, ceea ce indică faptul că aceste gene nu mai pot codifica o proteină funcțională și sunt considerate ca fiind pierdute.

Screening pentru pierderile de gene convergente legate de dietă.

Am adoptat abordarea Forward Genomics (61, 62) și am examinat genele în care% intact este, în general, mai mic într-un grup comparativ cu celălalt grup (9). Pentru a identifica pierderile genelor asociate erbivorilor, am căutat gene în care cel puțin 10% din speciile erbivore au pierdut gena (% intact ≤ 60%), în timp ce cel puțin 80% din speciile carnivore au o genă intactă (% intact ≥ 90%). Am cerut ca speciile erbivore cu pierdere de gene să aparțină cel puțin trei descendențe independente. O abordare analogă a fost aplicată pentru a identifica pierderile de gene convergente la carnivore. Am exclus genele care s-au pierdut numai în carnivorele cu vedere slabă (aluniță aurie a pelerinei, aluniță cu nas stelat, pangolin și lilieci insectivori), deoarece astfel de pierderi genetice pot fi legate de vedere, dar nu și de dietă.

Validarea pierderii genelor.

În primul rând, am validat corectitudinea mutațiilor codonului de oprire și a mutațiilor cadrelor cu citiri ADN neasamblate furnizate de Centrul Național pentru Arhiva de citire a secvențelor informaționale de biotehnologie sau Arhiva de urmărire (63), așa cum s-a descris anterior (64, 65). În al doilea rând, am verificat manual că fiecare genă pierdută este localizată în contextul de sinteză ancestrală prin inspectarea lanțurilor de aliniere în perechi din Universitatea din California, Santa Cruz Genome Browser (66) pentru prezența genelor din amonte și din aval. Această examinare a locusului genomic care adăpostește gena pierdută a fost, de asemenea, utilizată pentru a exclude că o copie intactă a genei pierdute există în altă parte a genomului. În al treilea rând, în plus față de genomurile furnizate de alinierea întregului genom (10), am investigat manual pentru cele șase gene dacă aceleași mutații inactivante apar în genomi sau ADN citesc date ale altor mamifere care sunt specii surori față de cele care au pierdut gena.

Mulțumiri

Mulțumim Sylvia Ortmann și Irina Ruf pentru comentarii utile asupra manuscrisului, și Facilităților Serviciilor de Calcul ale Institutului Max Planck de Biologie și Genetică a Celulelor Moleculare și Institutului Max Planck pentru Fizica Sistemelor Complexe pentru sprijinul lor. Această lucrare a fost susținută de Societatea Max Planck, Fundația Germană de Cercetare (Grant HI1423/3-1) și Asociația Leibniz (Grant SAW-2016-SGN-2).

Note de subsol

Pre 1 Adresa actuală: Deutsche Forschungsgemeinschaft - Centrul pentru terapii regenerative Dresda, Carl Gustav Carus Facultatea de medicină, Technische Universität Dresden, 01069 Dresda, Germania.

↵ 2 Adresa actuală: Institutul Paul Langerhans Dresda al Centrului Helmholtz din München la Spitalul Universitar Carl Gustav Carus, Facultatea de Medicină, Universitatea Tehnică Dresda, 01069 Dresda, Germania.

↵ 3 Adresa actuală: Centrul german pentru cercetarea diabetului, D-85764 Neuherberg, Germania.

Contribuțiile autorului: N.H. și M.H. cercetare proiectată; N.H. cercetări efectuate; V.S. a contribuit cu noi reactivi/instrumente analitice; N.H., V.S. și M.H. date analizate; și N.H. și M.H. a scris ziarul.

Autorii nu declară niciun conflict de interese.