Editat de Harvey Cantor, Dana - Farber Cancer Institute, Boston, MA și aprobat pe 19 iulie 2007 (primit pentru revizuire 7 aprilie 2007)

osteopontina

Abstract

Osteopontina (OPN) este o proteină multifuncțională implicată atât în ​​aderența celulară, cât și în semnalizarea celulară prin interacțiunile sale cu anumite integrine și variante CD44. Este un jucător activ în multe procese fiziologice și patologice, inclusiv remodelarea țesuturilor și supraviețuirea celulară (1, 2). OPN a fost identificat ca un factor major care reglementează răspunsurile imune și inflamația; expresia sa este reglată în sus în celulele T activate, macrofage și celulele naturale ucigașe (3, 4). Este clasificată ca citokină T helper-1 (Th1) deoarece îmbunătățește producția de citokine Th1 IFN-γ și IL-12 și inhibă producerea citokinei T helper-2 (Th2) IL-10 (5, 6 ). Deși este o citokină proinflamatorie asociată cu boli autoimune, răspunsul inflamator Th1, funcția celulelor B și funcția naturală a celulelor T, are și funcții antiinflamatorii, cum ar fi inhibarea inducerii sintazei inductibile a oxidului azotic și inhibarea producției de citokine Th2 . (7-14). Reglarea sa în sus este, de asemenea, un semn distinctiv pentru multe tulburări patologice majore, cum ar fi bolile cardiovasculare, cancerul și bolile pulmonare (12, 15).

Expresia OPN este crescută ca răspuns la diferiți factori de stres, inclusiv la stres fizic și chimic (16, 17). O conexiune între stres și funcția imunitară a fost demonstrată în diferite paradigme experimentale (18). Stresul poate îmbunătăți sau afecta funcția sistemului imunitar, în funcție de tipul și durata acestuia. Hormonii de stres, cum ar fi cortizolul, joacă un rol esențial în modularea răspunsurilor proinflamatorii/antiinflamatorii și a echilibrului citokinelor TH1/Th2, influențând astfel susceptibilitatea și rezultatul diferitelor boli legate de imunitate (19). În timp ce stresul cronic este imunosupresor și duce la o vulnerabilitate crescută la infecții și cancer, stresul acut promovează imunoprotecția prin imunitate celulară (20-22). Din câte știm, rolul OPN în răspunsul organelor imune la stres nu a fost examinat.

Rezultate

Deficitul de OPN protejează șoarecii de pierderea în greutate și de atrofia de organe limfoide.

HU provoacă atrofie semnificativă a organelor limfoide. Splina și timusul au fost disecate de la șoareci martori și suspendați. Organele întregi extrase chirurgical au fost introduse într-un vas de cultură celulară umplut cu mediu și scanate pe un scaner digital.

Șoarecii OPN -/- sunt rezistenți la moartea celulelor apoptotice induse de HU atât în ​​timus cât și în splină. Șoarecii de tip sălbatic și OPN -/- au fost supuși HU timp de 20 de ore. Celulele apoptotice pozitive TUNEL din secțiunile de parafină ale țesuturilor splinei și timusului sunt prezentate în maro închis pe un fundal contracolorat cu metil verde.

OPN promovează pierderea de splenocite și celule T imature induse de stres în timus.

Distribuția subpopulației limfocitelor în splină și timus

Analiza subpopulațiilor limfocitare prin citometrie în flux. (A) Timocitele izolate din șoareci OPN +/+ și OPN -/- în suspensie și martor au fost colorate cu anticorpi anti-CD8 și anti-CD4 conjugați cu fluorocrom și analizate prin citometrie în flux. Graficele cu bare indică numărul de celule din diferite subpopulații la șoareci OPN +/+ și OPN -/- (medie ± SEM, n = 4-7 animale). (B) Splenocitele izolate din șoareci OPN +/+ și OPN -/- suspendați și martori au fost colorate cu anticorpi anti-B220, anti-CD8 și anti-CD4 conjugați cu fluorocrom și analizați prin citometrie în flux. Datele reprezintă media ± SEM de patru până la șapte animale în fiecare punct de date. ***, Semnificație statistică la șoareci P -/- supuși HU.

Corticosteronul, principalul hormon al stresului la rozătoare, este rapid reglat în sus ca răspuns la stres, ducând la inducerea apoptozei limfocitare substanțiale (19). Interesant, s-a demonstrat că blocarea receptorilor steroizi la șoareci poate suprima reducerea limfocitelor induse de HU (24). Pentru a determina dacă OPN joacă un rol în reglarea producției de glucocorticoizi după HU, am măsurat atât nivelurile de corticosteron, cât și OPN în serul șoarecilor după HU. Am constatat că, deși nivelul OPN nu a fost modificat la șoarecii OPN +/+ (datele nu sunt prezentate), HU a provocat o creștere de aproximativ 5 ori a nivelurilor de corticosteroizi în serul șoarecilor OPN +/+, dar nu și la șoarecii OPN -/- (Fig. 6). Această constatare sugerează că OPN este necesar pentru reglarea în sus a hormonului steroid ca răspuns la stresul indus de HU. Când dexametazonă exogenă a fost furnizată celulelor izolate de la șoareci OPN +/+ și OPN -/-, nu a existat nicio diferență în rata morții celulare induse (Fig. 7), indicând faptul că moartea celulelor limfoide induse de steroizi nu este afectată în OPN -/- celule. Inferația este că OPN endogen acționează în amonte de hormonul corticosteron, contribuind eventual la creșterea producției sale ca răspuns la stresul indus de HU și contribuind astfel indirect la moartea celulelor limfoide.

Moartea celulară indusă de dexametazonă nu a fost afectată la șoarecii OPN -/-. Celulele OPN +/+ și OPN -/- au fost tratate cu dexametazonă timp de 16 ore la 37 ° C, iar procentul de celule vii rămase a fost evaluat prin citometrie în flux cu colorare cu iodură de propidiu. WT, tip sălbatic; KO, knockout; spl, splina; ta, timus.

OPN reglează proliferarea celulelor imune și producția de citokine ca răspuns la HU.

OPN este implicat în răspunsuri imune înnăscute și adaptative, de exemplu recrutarea macrofagelor și limfocitelor în locurile de rănire și reglarea activităților acestora. Expresia sa este crescută ca răspuns la stresul mecanic al osului și al vasculaturii (12, 25, 31). Nivelurile OPN sunt, de asemenea, crescute ca răspuns la stresurile oxidative existente în tumori, după leziuni de reperfuzie și în boli inflamatorii, cum ar fi boala inflamatorie a bolului, boala pulmonară obstructivă cronică și boala Parkinson (17, 32, 33). Constatarea noastră că șoarecii lipsiți de OPN sunt mai puțin supuși atrofiei organelor limfoide induse de stres este interesantă deoarece implică faptul că OPN funcționează ca un mediator al stresului.

Analiza microarray a relevat că OPN este necesar pentru o expresie îmbunătățită a genei p53 la șoarecii HU (34). Nivelurile crescute de p53 determină celulele să se angajeze în apoptoză sau să înceteze divizarea ca răspuns la efectele dăunătoare ale stresului; cu toate acestea, rolul p53 în apoptoza indusă de HU la limfocite nu a fost investigat. Rezultatele noastre au arătat o pierdere mai mică de celule la șoareci OPN -/- după 3 zile de HU, în concordanță cu un răspuns p53 diminuat la șoareci OPN -/-. Aceste date relevă faptul că OPN acționează pentru a media semnalizarea stresului în amonte de gene care reglementează apoptoza și biosinteza sau eliberarea corticosteronului. Este interesant de remarcat faptul că Marsh și colab. (39) au raportat că șoarecii OPN -/- au crescut praguri mecanosenzoriale, contribuind probabil la toleranța lor crescută la stresurile impuse în această cercetare.

Materiale și metode

Șoarecii OPN -/- au fost generați (37) și menținuți într-un fundal 129, împreună cu controale izogene de tip sălbatic, în Rutgers Nelson Animal Facility (Piscataway, NJ), care este acreditat de Asociația pentru Evaluare și Acreditare a Animalelor de Laborator Îngrijesc și se află sub îngrijirea unui medic veterinar certificat. Toate animalele utilizate în experimente au fost potrivite în funcție de vârstă și sex.

Descărcarea membrelor posterioare.

Șoarecii au fost în cuști individual și suspendați timp de 3 zile de coadă folosind o bandă de bandă chirurgicală adezivă atașată la un lanț agățat de un scripete. Șoarecii au fost suspendați la un unghi de 25 ° față de podea, doar membrele anterioare atingând podeaua (24, 38). Hrana și apa au fost furnizate ad libitum. Șoarecii martori au fost adăpostiți în condiții similare, cu excepția faptului că nu au fost suspendați. Acest protocol a fost aprobat de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor Rutgers (nr. 97: 031). Șoarecii au fost cântăriți înainte și după ce au fost supuși HU.

Numărul de celule și analiza markerului de suprafață.

După 3 zile de HU, șoarecii au fost uciși prin inhalare de CO2. Timusul și splina au fost excizate și s-au preparat suspensii unicelulare. Numărul total de celule a fost determinat cu un hemocitometru. Subpopulațiile limfocitare specifice au fost identificate pe baza markerilor de suprafață celulară prin citometrie în flux; s-au folosit anticorpi monoclonali conjugați cu fluorescență, inclusiv CD4, CD8 și CD45R/B220 anti-șoarece de șobolan (toate de la BD Biosciences - PharMingen, San Diego, CA). Celulele au fost incubate cu BD Fc Block (BD Biosciences - PharMingen) pentru a bloca legarea nespecifică înainte de colorare. Colorarea a fost determinată de FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Datele au fost achiziționate și analizate cu software-ul CellQuest.

Determinarea corticosteronului în ser.

Sângele a fost recoltat de la șoareci experimentali și martori OPN +/+ și OPN -/- imediat după HU. Serul a fost colectat și depozitat la -80 ° C. Nivelurile de corticosteron din probele de ser au fost evaluate cu un kit ELISA de corticosteron de la IBL America (Minneapolis, MN) conform instrucțiunilor producătorului.

Inducerea apoptozei de către dexametazonă.

Suspensiile monocelulare de splenocite și timocite au fost cultivate în plăci cu 96 de godeuri la 106 celule per godeu în prezența dexametazonei la diferite concentrații. După o incubație de 16 ore la 37 ° C, celulele au fost spălate în PBS și colorate cu iodură de propidiu în prezența 100 μg/ml RNază/0,1% saponină. Procentul de celule apoptotice a fost determinat prin analiza conținutului ADN cu citometrie în flux.

Detectarea apoptozei in situ (testul TUNEL).

Fragmentarea ADN-ului nuclear în celulele apoptotice a fost detectată pe secțiuni de parafină utilizând un kit TACS.XL DAB in situ de detectare a apoptozei de la Trevigen (Gaithersburg, MD). Incorporarea BrdU prin deoxinucleotidil transferază terminală la locul fragmentării ADN-ului a fost detectată de un anticorp anti-BrdU biotinilat foarte specific și sensibil și vizualizată de un conjugat streptavidină - peroxidază de hrean. Secțiunile de țesut au fost contracolorate cu verde de metil.

Test de proliferare a celulelor T.

Suspensiile monocelulare de timocite și splenocite au fost placate în plăci cu 96 de godeuri care au fost pre-acoperite cu anti-CD3 la 5 μg/ml în PBS timp de 24 de ore la 4 ° C. Celulele au fost însămânțate la 5 × 105 celule per godeu în mediu complet (mediu RPMI 1640/10% FBS inactivat la căldură/55 μM 2-mercaptoetanol/2 mM l -glutamină/50 unități/ml penicilină/50 μg/ml streptomicină) suplimentat cu 1 μg/ml anti-CD28. Celulele au fost cultivate timp de 3 zile și apoi marcate cu [3H] timidină timp de 16 ore. Incorporarea [3H] timidinei a fost măsurată prin numărarea β-scintilației.

Determinarea producției de citokine.

Supernatanții culturilor de timocite sau splenocite stimulate de anti-CD3/anti-CD28 au fost recoltați după 48 de ore. Citokinele IL-2, IL-10 și MCP-1 au fost măsurate cu kituri DuoSet ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN), conform instrucțiunilor producătorului.

Analize statistice.

Fiecare experiment a fost efectuat cel puțin de două ori cu trei sau mai mulți șoareci din fiecare grup. Datele sunt exprimate ca medie ± SEM. Diferențele dintre grupuri au fost analizate utilizând testul t Student asociat cu software-ul Excel.

Mulțumiri

Mulțumim lui David Shen pentru asistență cu cifrele digitale, Getta Denhardt și Bhumika Desai pentru asistență tehnică și lui Guangwen Ren și Arthur I. Roberts pentru ajutor în descărcarea membrelor posterioare. Această lucrare a fost susținută parțial de Grantul de cercetare biomedicală Busch 649164 (către DTD), Grantul național al societății de scleroză multiplă 3699A10 (către DTD), Grantul Fondului de comercializare a tehnologiei Rutgers 04-2042-014-32 (către DTD) și Cercetarea biomedicală a spațiului național Grantul Institutului IIH00405 (către YS), care este susținut de Administrația Națională pentru Aeronautică și Spațiu prin Acordul de Cooperare NCC 9-58.

Note de subsol

Contribuțiile autorului: Y.S. și D.T.D. a contribuit în mod egal la această lucrare; K.X.W. și D.T.D. cercetare proiectată; K.X.W. și D.T.D. cercetări efectuate; K.X.W. și Y.S. date analizate; și K.X.W., Y.S. și D.T.D. a scris ziarul.

Autorii nu declară niciun conflict de interese.

Acest articol este o trimitere directă PNAS.