Abstract

obezitatea este un factor de risc pentru astm. Studii transversale multiple efectuate pe populații mari de adulți și copii cu medii etnice multiple indică faptul că prevalența astmului este mai mare la persoanele obeze și supraponderale. În plus, mai multe studii prospective mari arată că obezitatea antedatează astmul bronșic (vezi recenziile recente din Ref. 16, 61 și 63). Pacienții astmatici obezi care pierd greutate prezintă mai puține simptome de astm, rate crescute ale fluxului de aer, variabilitate redusă a debitului de vârf și un control mai bun al astmului (21, 43, 68). Obezitatea pare, de asemenea, să aibă un impact asupra controlului astmului și asupra eficacității anumitor medicamente pentru astm (13, 36, 51, 55).

asupra

Metformina biguanidă este un agent de sensibilizare oral la insulină utilizat în mod obișnuit în tratamentul diabetului de tip 2. Tratamentul cu metformină ameliorează, de asemenea, fenotipul diabetic al șoarecilor obezi, reducând glucoza de post și atenuând expresia enzimelor gluconeogene în ficat (7, 17, 18, 23, 39, 70). La subiecții umani, metformina atenuează și aspecte ale inflamației sistemice care este asociată cu obezitatea (4, 10-12, 20). Scopul prezentului studiu a fost de a determina dacă hiperglicemia contribuie la fenotipul pulmonar al șoarecilor obezi. În consecință, am tratat slabul de tip sălbatic și obez db/db șoareci pe cale orală fie cu apă, fie cu metformină în fiecare zi timp de 2 săptămâni. Au fost utilizate două cohorte de șoareci tratați cu metformină și apă. Într-o cohortă, reacția căilor respiratorii a fost evaluată la 24 de ore după ultimul tratament pentru a determina dacă metformina ar putea atenua AHR înnăscut al db/db șoareci. În cealaltă cohortă, 24 după ultima metformină sau tratamentul apei, șoarecii au fost expuși acut la O3 [2 părți pe milion (ppm) timp de 3 ore] și a fost examinat răspunsul inflamator care a urmat.

Animale.

Acest studiu a fost aprobat de Comitetul permanent pentru animale din zona medicală Harvard. Femei obeze db/db și ob/ob șoarecii au fost cumpărați de la Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Deoarece acești șoareci se aflau pe un fundal C57BL/6J, șoarecii C57BL/6J de tip sălbatic, de vârstă și sexe au fost folosiți ca martori. Ambele tipuri de șoareci sunt hiperfagici, hipometabolici, hiperinsulinemici, hiperglicemici și obezi masivi (37). Pentru a confirma eficacitatea tratamentului cu metformină asupra glucozei serice, am folosit ambele ob/ob și db/db șoareci. Pentru toate celelalte experimente, am folosit db/db doar șoareci.

Protocol.

Șoarecilor obezi și slabi li s-au administrat fie apă, fie metformină (300 μg/g) prin gavaj zilnic timp de 2 săptămâni. Alții au raportat reduceri ale glicemiei la jeun în db/db șoareci cu un protocol de tratament similar (17, 18). Au fost utilizate trei cohorte. Într-o cohortă, după ultimul tratament, ob/ob și db/db șoarecii au fost postiti peste noapte pentru măsurarea glicemiei la jeun folosind glucometrul Prestige Smart System IQ (Home Diagnostics, Fort Lauderdale, FL) (4 șoareci tratați cu metformină și 4 șoareci tratați cu apă). În a doua cohortă, la 24 de ore după ultimul tratament, șoarecii au fost anesteziați pentru măsurarea capacității de reacție a căilor respiratorii, urmat de colectarea serului pentru evaluarea inflamației sistemice (n = 6-8 șoareci per grup). Rețineți că nu am reușit să cateterizăm vena pentru livrarea de metacolină la un șoarece, dar am colectat încă o probă de sânge prin puncție cardiacă la acest șoarece. În ultima cohortă, șoarecii au fost expuși la O3 (2 ppm timp de 3 ore) la 24 de ore după ultimul tratament cu gavaj. La patru ore după expunere, șoarecii au fost eutanasiați și s-a efectuat spălarea bronhoalveolară (BAL) (n = 5-6 șoareci/grup).

Expunere la O3.

Șoarecii treji au fost așezați fără restricții în cuști individuale din plasă de sârmă în interiorul unei camere de expunere din oțel inoxidabil și plexiglas și expuși la O3 (2 ppm timp de 3 ore) așa cum s-a descris anterior (29, 66). Protocolul de expunere la O3 a fost ales pentru a permite compararea cu datele altor anchetatori care studiază inflamația acută indusă de O3 la șoareci (5, 6, 25, 27, 49, 56, 72), inclusiv db/db șoareci (41). Această concentrație este mai mare decât concentrațiile tipice utilizate pentru expunerile umane. Cu toate acestea, doza inhalată de O3 este produsul nu numai al concentrației de ozon și al timpului de expunere, ci și al ventilației minuscule (75). Expunerile umane sunt de obicei efectuate cu subiecți care fac exerciții pentru a crește ventilația lor mică (3). În schimb, șoarecii suferă o scădere profundă a metabolismului la expunerea la O3, iar la 2 ppm O3, ventilația lor minimă scade la valori doar o treime din cele măsurate înainte de expunere (64). Prin urmare, în timp ce concentrațiile utilizate pentru studiile la om și șoareci pot diferi în mod substanțial, doza reală inhalată de ozon este probabil mult mai comparabilă.

Mecanica pulmonară.

Șoarecii neexpuși au fost anesteziați cu xilazină (7 mg/kg) și pentobarbital sodic (50 mg/kg). Traheea a fost canulată cu un adaptor pentru tuburi, iar vena cozii a fost canulată pentru livrarea clorurii de acetil-β-metilcolină (metacolină; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Șoarecii au fost ventilați cu un ventilator specializat (flexiVent; SCIREQ, Montreal, QC, Canada). Frecvența a fost setată la 150 Hz și 180 Hz în tip sălbatic și db/db șoareci, respectiv. Frecvența ușor mai mare utilizată pentru db/db șoareci au fost aleși deoarece acești șoareci respiră spontan la o frecvență mai mare, dar cu aproximativ același volum mareic ca șoarecii de tip sălbatic (41). Prin urmare, volumul mareelor ​​a fost stabilit la 0,3 ml în ambele tulpini. O fereastră mare a fost făcută de fiecare parte a peretelui pieptului tăind o parte a unor nervuri și țesutul dintre ele. Astfel, plămânii au fost în mare parte expuși la presiunea atmosferică, iar măsurătorile făcute au redus orice contribuție a peretelui toracic la mecanica pulmonară. S-a aplicat o presiune expiratorie pozitivă de 3 cmH2O prin plasarea liniei expiratorii sub apă.

Noi și alții am raportat că părțile reale și imaginare ale ZL în funcție de frecvență se conformează bine acestui model în acest interval de frecvență (24, 53, 54).

Spălarea bronhoalveolară.

La patru ore după încetarea expunerii la O3, șoarecii au fost eutanasiați cu o supradoză de sodiu pentobarbital. Traheea a fost canulată și plămânii au fost spălate de două ori cu 1 ml PBS/0,6 mM EDTA. BAL a fost centrifugat, iar celulele BAL totale și diferențialele au fost evaluate așa cum s-a descris anterior (28-30, 32). Supernatantul BAL a fost înghețat la -80 ° C și ulterior analizat pentru chemokina derivată de keratinocite (KC), proteina inflamatorie macrofagă 2 (MIP-2), proteina inductibilă interferon 10 (IP-10), chemokina CXC indusă de LPS (LIX ), și proteina chimiotratantă monocitică 1 (MCP-1), utilizând kituri de testare imunosorbentă legată de enzime DuoSet (ELISA) (R&D Systems, Minneapolis, MN). Acești factori chimiotactici neutrofili au fost aleși deoarece sunt induși în mod caracteristic de expunerea acută la O3 și pentru că s-a raportat că contribuie la influxul de neutrofile care însoțește expunerea acută la O3 la șoareci (14, 29, 32, 33, 41, 45, 66, 71 ). Foarte important, în prezența hiperglicemiei, alți stimuli inflamatori acuti duc, de asemenea, la inducerea mai mare a multora dintre aceste chimiokine (19).

Markeri ai inflamației sistemice.

Probele de sânge au fost obținute prin puncție cardiacă, ser izolat și depozitate la -20 ° C până la testarea ELISA pentru MCP-1, leptină și adiponectină (sisteme R&D). Deoarece expunerea la O3 în sine poate modifica acești factori, testele au fost efectuate numai pe serul de șoareci utilizat în studiile de mecanică.

analize statistice.

Diferențe în greutatea corporală, RL, Raw, G, H, și parametrii BAL și în markerii serici ai inflamației au fost evaluați prin ANOVA factorială utilizând genotipul și tratamentul medicamentos ca efecte principale. În fiecare caz, testul diferenței cu cel mai puțin semnificativ Fishers a fost utilizat pentru comparații post hoc. Comparațiile glucozei serice au fost făcute de Student nepereche t-teste. Analizele statistice au fost efectuate cu software-ul SAS (SAS Institute, Cary, NC). Toate rezultatele sunt prezentate ca mijloace ± SE, cu excepția cazului în care se indică altfel. P

tabelul 1. Măsurători inițiale ale mecanicii pulmonare totale, ale căilor respiratorii și parenchimatoase la șoareci obezi db/db și slabi de tip sălbatic tratați cu apă sau metformină

Valorile sunt medii ± SE. Măsurătorile au fost efectuate la 24 de ore după ultimul tratament cu gavaj. RL, rezistență pulmonară; Rezistență brută, a căilor respiratorii; G, coeficientul de amortizare a țesutului pulmonar; H, coeficientul elastanței țesutului pulmonar.

* P gras șoarecii și șoarecii cu obezitate indusă de dietă sunt, de asemenea, rezultatul îmbunătățirii căilor respiratorii, mai degrabă decât a răspunsurilor țesuturilor (31, 32, 66).

FIG. 1.Modificări ale rezistenței pulmonare totale (RL) (A), rezistența căilor respiratorii (Raw)B) și coeficientul de amortizare a țesutului pulmonar (G) (C) indusă de metacolină intravenoasă în tip sălbatic (WT) și db/db șoareci. Șoarecii au fost tratați prin gavaj cu apă sau metformină o dată pe zi timp de 2 săptămâni. Măsurătorile au fost făcute la 24 de ore după ultimul tratament. Rezultatele sunt media ± SE a datelor de la 6-7 șoareci din fiecare grup. *P

Metformina nu a avut niciun efect asupra modificărilor mecanicii pulmonare induse de metacolină db/db sau șoareci de tip sălbatic. ANOVA factorială a indicat efecte semnificative ale genotipului (P

FIG. 2.Neutrofile bronhoalveolare de spălare (A), chimiokine derivate din keratinocite (KC) (B), proteina inflamatorie macrofagică 2 (MIP-2)C), Chimiochină C-X-C indusă de LPS (LIX)D), proteină inductibilă cu interferon 10 (IP-10)E), și proteina chimiotratantă monocitică 1 (MCP-1)F) în WT și db/db șoareci expuși la O3 (2 părți pe milion timp de 3 ore). Șoarecii au fost studiați la 4 ore după încetarea expunerii la O3 și au fost tratați prin gavaj cu apă sau metformină în fiecare zi timp de 2 săptămâni înainte de expunere. Rezultatele sunt media ± SE a datelor de la 5-6 șoareci per grup. *P

De asemenea, am măsurat concentrațiile de BAL ale chemokinelor care sunt induse de O3 și au activitate chimiotactică pentru neutrofile (Fig. 2). S-a dovedit că hiperglicemia are impact asupra inducției multor dintre aceste chemokine care apare ca răspuns la alți stimuli inflamatori (19, 40). ANOVA factorială a indicat un efect semnificativ al tulpinii asupra BAL MIP-2, KC, MCP-1, LIX și IP-10 (P

FIG. 3.Ser MCP-1 (A), leptina (B) și adiponectină (C) în WT neexpus și db/db șoareci tratați cu metformină sau apă în fiecare zi timp de 2 săptămâni. Rezultatele sunt media ± SE a datelor pentru 6-8 șoareci per grup. *P

Datele noastre indică faptul că 2 săptămâni de tratament zilnic cu metformină atenuează hiperglicemia la șoarecii obezi fără a modifica nici AHR înnăscut, nici răspunsurile lor inflamatorii pulmonare crescute la O3. Datele indică faptul că fenotipul pulmonar al acestor șoareci obezi este probabil fără legătură cu hiperglicemia lor.

Pentru a evalua rolul potențial al hiperglicemiei, am tratat db/db șoareci cu agent antihiperglicemic metformin. Metformina a determinat o reducere marcată a glicemiei în repaus alimentar, în concordanță cu studiile anterioare la șoareci obezi tratați în mod similar (17, 18, 70). Metformina a redus, de asemenea, glucoza serică la non-post db/db șoareci, deși glucoza a rămas cu mult peste valorile de tip sălbatic. Capacitatea metforminei de a reduce glucoza din sânge derivă din capacitatea sa de a crește absorbția glucozei în mușchiul scheletic (47) și de a reduce gluconeogeneza hepatică (69). Aceste acțiuni par a fi mediate prin modificări ale sensibilității la insulină (7) induse de activarea proteinei kinazei activate de AMP (AMPK), un senzor celular de stare energetică (76).

În conformitate cu rapoartele anterioare (41), am observat o reacție mai mare a căilor respiratorii la metacolină intravenoasă la obezi db/db versus șoareci slabi de tip sălbatic (Fig. 1). Cu toate acestea, chiar dacă metformina a redus substanțial hiperglicemia la jeun la acești șoareci, nu le-a modificat AHR înnăscut (Fig. 1). Rezultatele sugerează că unele aspecte ale fenotipului acestor șoareci obezi, altele decât hiperglicemia, sunt responsabile de AHR, deși este de conceput că și creșteri moderate ale glicemiei, cum ar fi rămas în post db/db șoarecii tratați cu metformină pot contribui la AHR.

Pe scurt, datele noastre indică acest lucru 1) AHR înnăscut și 2) influxul crescut de neutrofile induse de O3 și expresia chemokinelor sunt observate la șoareci obezi. Aceste diferențe legate de obezitate nu au fost atenuate de tratamentul cu metformină, în ciuda reducerii glicemiei la jeun, sugerând că este puțin probabil ca hiperglicemia să țină cont de fenotipul pulmonar al acestor șoareci obezi.

Acest studiu a fost susținut de subvențiile Institutului Național de Științe ale Mediului ES-013307 și ES-00002, de subvențiile Institutului Național de Inimă, Plămân și Sânge HL-084044 și HL-33009 și de un dar generos de la Paul și Mary Finnegan.