Abstract

Introducere

Simetria inflamației este o caracteristică fundamentală a artritei reumatoide (RA; Arnett și colab., 1988) și duce la malformații articulare severe și imobilitate pe scară largă (Clarke și colab., 1994; Zangger și colab., 2005). În ciuda unei largi bibliografii privind etiologia și patogeneza RA, există o înțelegere redusă a cauzei (cauzelor) simetriei acestei boli.

În timp ce răspunsul imun este de o importanță evidentă în progresia RA, este dificil de înțeles cum acest lucru singur poate sta la baza modelului simetric al implicării articulațiilor. Levine și colegii săi au propus că această simetrie ar putea fi susținută de inervația articulară și au propus o contribuție neurogenă atât la inflamația existentă, cât și la modelul simetric al RA (Levine și colab., 1985a, b; Levine și Basbaum, 1990). Un corp considerabil de dovezi susține acum ipoteza „neurogenă” (Donaldson și colab., 1995; Rees și colab., 1996; Decaris și colab., 1999). Studiile epidemiologice demonstrează că articulațiile afectate tind să prezinte un model de imagine oglindă (Egger și colab., 1995; Zangger și colab., 2005). Pacienții care dezvoltă RA după leziuni nervoase prezintă dispariții ale articulațiilor denervate (Thompson & Bywaters, 1962; Glick, 1967; Glynn & Clayton, 1976; Veale și colab., 1993) și RA se pot rezolva în articulațiile afectate care ulterior își pierd inervația senzorială. (Lapadula și colab., 1997).

Modelele animale de RA susțin ipoteza neurogenă. Modelul bine stabilit al adjuvantului complet Freund (CFA) la șobolani prezintă simetria implicării articulațiilor după 2-4 săptămâni, în funcție de locul și concentrația injecției CFA (Donaldson și colab., 1993; Decaris și colab., 1999). Inflamația indusă de CFA rămâne unilaterală în urma leziunii nervului omolog contralateral cu neurotoxina capsaicină (Donaldson și colab., 1995), implicând subtipul 1 al receptorului vaniloid (TRPV1; cunoscut și sub denumirea de VR-1), care exprimă neuroni în răspândirea inflamației. Mai mult, activitatea neuronală antidromică evocată mecanic (departe de SNC) a fost înregistrată în nervul articular contralateral (Rees și colab., 1996). Substanța neuropeptidelor vasoactive P (SP) și peptida legată de gena calcitoninei (CGRP) sunt eliberate de la terminalele aferente primare după activare (White & Helme, 1985); cresc atât permeabilitatea vasculară, cât și vasodilatația (Brain și colab., 1985; Ferrell & Russell, 1986; Holzer, 1998) și sunt chemotaxice pentru limfocite, declanșând astfel inflamația (Helme și colab., 1987; Mantyh, 1991; Holzer, 1998) . Conținutul SP sinovial și CGRP crește rapid și bilateral după inducerea artritei CFA (Bileviciute și colab., 1993) și contribuie probabil la implicarea articulației contralaterale (Lam și colab., 2004).

Deși acum este larg acceptat faptul că sistemul nervos joacă un rol important în răspândirea contralaterală a inflamației, o mare parte din această înțelegere se bazează pe studii de leziuni nervoase. Foarte puține studii au studiat în mod direct funcția nervilor contralaterali în modele de RA. Scopul nostru a fost să testăm ipoteza că funcția nervului contralateral este modificată în urma dezvoltării artritei. Mai mult, studiul nostru a urmărit să determine dacă și cum ar putea fi modificată această funcție modificată și dacă există modificări sub acoperire care indică inflamația în articulația contralaterală.

Materiale și metode

Animale

Toate procedurile pe animale au fost efectuate în conformitate cu legislația Regatului Unit [Legea privind animalele (procedurile științifice), 1986], au fost licențiate de Home Office din Marea Britanie și urmează instrucțiunile Asociației Internaționale pentru Studiul Durerii (Zimmermann, 1983). Șobolani masculi Wistar (250-300 g) au fost obținuți de la B și K (Bristol, Marea Britanie), au adăpostit patru pe cușcă și au fost menținuți pe hrană și apă ad libitum cu un ciclu de 12 ore lumină - întuneric.

Droguri

Pentobarbitalul de sodiu a fost obținut în forma sa de sodiu de la Sigma (Dorset, Marea Britanie) și a fost alcătuit intern pentru a permite i.p. și i.v. injecție pentru inducție anestezică și, respectiv, întreținere. Capsaicina a fost obținută de la Tocris (Bristol, Marea Britanie) și a fost alcătuită într-un vehicul 10% etanol, 10% Tween 80 și 80% soluție salină. Dipirona (metamizol) a fost obținută de la Sigma (Dorset, Marea Britanie) și a fost dizolvată în soluție salină. Lignocaina, 2%, a fost obținută de la Deproco Ltd (Kent, Marea Britanie).

Inducerea inflamației induse de CFA

O scurtă anestezie a fost indusă cu halotan (3% în O2); odată ce s-a realizat areflexia, 250 µg/100 µL CFA (Mycobacterium tuberculosis în ulei mineral vehicul) a fost injectat prin tendonul rotulian în articulația genunchiului drept pentru a induce artrita (Rees și colab., 1994). Șobolanii au fost returnați în cușca de acasă și au fost lăsați să se recupereze și au fost monitorizați zilnic pentru a deranja mersul. Măsurătorile diametrului articulației genunchiului ipsilaterale și contralaterale au fost luate de la șobolani artritici folosind etriere în ziua experimentelor electrofiziologice.

Proceduri chirurgicale

La trei până la cinci zile după injectarea intraarticulară de CFA, anestezia a fost indusă cu pentobarbital de sodiu (60 mg/kg, ip), iar vena jugulară externă și traheea au fost canulate pentru menținerea anesteziei (10 mg/kg/h, iv) și compensarea căilor respiratorii, respectiv. Temperatura miezului corpului a fost menținută (36,5-37,5 ° C) prin utilizarea unei sonde de temperatură rectală conectată la o lampă de încălzire printr-o unitate de control feedback. Pielea și țesuturile conjunctive care acoperă aspectele anterioare ale genunchiului stâng și aspectul medial al coapsei au fost incizate de la fosa inghinală până la un punct imediat sub condilul medial al tibiei. Partea inferioară a piciorului a fost atașată la o platformă pentru stabilitate. Aspectul medial al piciorului a fost expus și a fost creat un bazin de ulei folosind pielea membrului posterior; acesta a fost umplut cu ulei mineral încălzit (37 ° C) (Sigma, Marea Britanie). Nervul safen stâng (contralateral la inflamație), care inervează membrul posterior, inclusiv articulația genunchiului, a fost disecat fără țesut conjunctiv într-un punct proximal al articulației genunchiului și secționat pentru a preveni înregistrarea activității aferente din părți mai distale ale șobolanului posterior. -limb.

Înregistrare extracelulară

Experimente de extravazare cu plasmă

Șobolanii care au primit o injecție de CFA în articulația genunchiului (cu 4 zile înainte) au fost anesteziați (pentobarbital 60 mg/kg, i.p.), iar vena jugulară externă și traheea au fost canulați. După o perioadă de timp pentru a permite stabilizarea după efectele acute ale intervenției chirurgicale (∼30-40 min), a fost injectat colorant albastru Evans (50 mg/kg, i.v.). La douăzeci de minute după administrarea albastră Evans șobolanii au fost perfuzați transcardic cu soluție salină. Ambele articulații ale genunchiului au fost disecate rapid, curățate de piele și mușchi, cântărite și plasate în formamidă apoi pe o rolă timp de 24 de ore la temperatura camerei. Nivelurile de colorant albastru Evans extras au fost măsurate spectrofotomic (620 nm) și exprimate ca pg/mL/g. Tehnica Evans albastru este o metodă bine stabilită și a fost utilizată în mod obișnuit pentru a evalua efectele stimulării aferente nociceptive asupra funcției vasculare (Janig & Lisney, 1989; Bharali & Lisney, 1992; Kolston & Lisney, 1993).

analize statistice

Datele sunt exprimate ca medie și SEM. Analiza statistică a fost efectuată cu test t nonparametric (Mann - Whitney), test t t perechi și anova uniparametric unidirecțional, după caz.

Rezultate

Dezvoltarea artritei

Toți șobolanii care au primit o injecție intra-articulară de CFA, cu 3-5 zile înainte, au dezvoltat o umflare semnificativă unilaterală și localizată a articulației genunchiului drept (ipsilateral, 1,32 ± 0,03; contralateral, 0,91 ± 0,01 cm diametru; P Fig. 1A și C). Activitatea evocată mecanic nu a fost nici robustă, nici reproductibilă și, prin urmare, ne-am concentrat pe studiul activității neuronale spontane. Pentru a determina dacă această activitate neuronală s-a datorat prezenței inflamației în articulația dreaptă a genunchiului, am efectuat experimente identice la șobolanii de control neinjectați (n = 5). În același timp de înregistrare ca la șobolanii CFA (0-20 min), șobolanii martor au prezentat niveluri foarte scăzute de activitate antidromică (Fig. 1B și C); când s-au făcut comparații statistice între cele două grupuri, activitatea înregistrată contralateral cu inflamația la șobolanii CFA a fost semnificativ mai mare decât cea observată la șobolanii martori netratați (P Fig. 1C). Într-un experiment, secționarea nervului safen care inerva articulația inflamată în timpul înregistrării, întrerupând astfel aportul sporit de la locul inflamației, nu a avut niciun efect asupra activității spontane contralaterale (datele nu sunt prezentate).

funcția

Efectul inflamației articulației genunchiului indusă de CFA asupra activității antidromice contralaterale. (A și B) Graficul potențialelor de acțiune antidromice spontane (vârf la vârf) înregistrate de la nervul safen stâng pe o perioadă de 5 minute dintr-un experiment tipic la (A) un șobolan CFA și (B) un șobolan de control. (C) Frecvența medie a AP-urilor antidromice spontane înregistrate de la nervul safen stâng pe o perioadă de 20 de minute a fost semnificativ mai mare la șobolanii care au primit o injecție intraarticulară de CFA (250 µg/100 µL; n = 16) în dreapta articulația genunchiului decât la șobolanii neinjectați martor (n = 5); ** P Fig. 2A). Lignocaina a provocat o abolire aproape completă a activității înregistrate în câteva secunde de la aplicare (Fig. 2A). Activitatea antidromică spontană a început să se recupereze la ± 15-20 min și a fost finalizată cu 1 oră (datele nu sunt prezentate). Deoarece se știe că nervul safen conține atât fibre nervoase senzoriale, cât și fibre simpatice într-un raport aproximativ de 4: 1 (Baron și colab., 1995), am căutat să clarificăm dacă activitatea observată a fost de origine senzorială sau simpatică. Am aplicat capsaicină (2%), un agonist la receptorul TRPV1 cunoscut pentru a bloca transmisia senzorială, direct pe nervul de la un loc proximal la locul de înregistrare (n = 6; Fig. 2B). Capsaicina a reușit să abolească aproape complet activitatea înregistrată, care nu și-a revenit pe parcursul timpului studiat (Fig. 2B). În unele experimente a existat o cantitate mică de activitate reziduală prezentă în urma aplicării capsaicinei.

Potențialele spontane de acțiune antidromice au provenit central și au fost transmise de neuronii senzitivi sensibili la capsaicină. (A) Lignocaina (2%) și (B) capsaicina (2%) aplicate direct pe nervul proximal către locul de înregistrare la șobolani CFA (n = 5 sau 6) au blocat generarea de AP antidromice spontane. * P Fig. 3B). Pentru a investiga dacă un agent farmacologic relevant din punct de vedere clinic ar putea modula nivelurile în creștere a activității antidromice spontane observate în urma inflamației induse de CFA, am administrat analgezic cu acțiune centrală, dipironă (50-250 mg/kg, iv) legat de paracetamol (acetaminofen) și a studiat efectul asupra frecvenței potențialelor de acțiune antidromice spontane. În majoritatea cazurilor (5/7 experimente) dipirona a redus frecvența activității antidromice spontane la niveluri care se apropie sau chiar sub nivelurile inițiale de activitate (Fig. 3A). În general, administrarea de dipironă a redus activitatea în neuronii senzoriali contralaterali, inhibând creșterea activității în timp, care a fost evidentă în experimentele de control al soluției saline (Fig. 3B). A existat un efect semnificativ al dipironei în timp, după cum se arată printr-o reducere semnificativă a zonei de sub curbă (ASC) în prezența dipironei în comparație cu experimentele de control salin (Fig. 3C;

Efectul inflamației induse de CFA a articulației genunchiului asupra extravazării colorantului albastru Evans ipsilateral și contralateral (țesut µg/ml/g). (A) Cantitatea de albastru Evans extras din articulațiile ipsilaterale și contralaterale ale genunchiului șobolanilor CFA (n = 11) a fost semnificativ mai mare decât cel extras din articulațiile genunchiului (stânga și dreapta) al șobolanilor martor (n = 4), *** P FIG. 4B) nu prezintă umflături. Acest lucru indică faptul că extravazarea cu albastru Evans poate fi crescută în circumstanțe în care permeabilitatea vasculară nu este clar modificată. Aceasta implică faptul că, în articulațiile contralaterale la o inflamație evidentă, funcția vasculară este modificată, dar permeabilitatea vasculară (care duce la edem) probabil nu este.

Discuţie

Modelele animale de RA demonstrează simetria implicării articulare (Donaldson și colab., 1993) și oferă o oportunitate ideală pentru studiul mecanismelor subiacente și dezvoltarea unor strategii potențiale de tratament. În trecut, utilizarea acestor modele, combinată cu leziunea nervoasă, a furnizat dovezi care sugerează că mecanismele neurogene sunt centrale în dezvoltarea și menținerea efectelor contralaterale (Levine și colab., 1985b; Bileviciute și colab., 1993; Mapp și colab. al., 1993; Donaldson și colab., 1995; Kidd și colab., 1995; Rees și colab., 1996; Decaris și colab., 1999; Lombard și colab., 1999; Lam și colab., 2004). Cu toate acestea, s-au efectuat puține studii electrofiziologice pentru a investiga în mod direct plasticitatea funcțională care apare în nervii senzoriali contralaterali după inducerea artritei. Datele noastre descriu pentru prima dată că un nerv senzorial contralateral la artrită conduce potențiale de acțiune spontane către periferie. În plus, datele noastre oferă dovezi că funcția sistemului vascular este modificată și în articulația contralaterală a genunchiului. Raportăm că aceste modificări au avut loc înainte de semne evidente de inflamație simetrică și facem ipoteza că plasticitatea raportată are implicații importante pentru răspândirea inflamației în acest model și poate reflecta modificările observate la om. Important, am putut demonstra că intervenția cu un analgezic cu acțiune centrală a fost capabilă să moduleze activitatea neuronală contralaterală.

În studiul de față, activitatea nervoasă antidromică spontană contralaterală a fost dependentă de prezența inflamației și a putut fi abolită cu lignocaină și capsaicină aplicate direct pe trunchiul nervos. Astfel, am confirmat că această activitate a fost neuronală, a apărut central și a apărut în fibrele senzoriale care exprimă TRPV1 (Pini și Lynn, 1991). La unele animale CFA am observat că o cantitate mică de activitate neuronală reziduală a fost prezentă după aplicarea capsaicinei, ceea ce înseamnă că poate exista activitate modificată în eferenții simpatici contralaterali (Helliwell și colab., 1998; Tominaga și colab., 1998; Smith și colab., 2004; Moalem și colab., 2005). Cu toate acestea, capsaicina perineurală previne răspândirea simetrică a artritei în acest model (Donaldson și colab., 1995), ceea ce implică faptul că neuronii senzitivi sensibili la capsaicină sunt esențiali pentru progresia simetrică a artritei.

Descoperirile noastre indică faptul că modificările centrale care contribuie la generarea activității antidromice și modificările ulterioare ale funcției vasculare sunt deja stabilite la 3-5 zile după injectarea CFA. Perioada relativ scurtă a modificărilor raportate este în acord cu rapoartele anterioare de efecte bilaterale (Kidd și colab., 1995; Rees și colab., 1996). Interesant este că stimularea antidromică a nervilor la intensitatea fibrei C evocă atât extravazarea unilaterală (Janig și Lisney, 1989), cât și bilaterală (Ferrell & Russell, 1986), ceea ce sugerează că intrarea senzorială modificată în măduva spinării poate induce schimbări foarte rapide în contralateral. ieșire. Extravazarea plasmatică a articulației genunchiului rezultată din stimularea nervului periferic este dependentă de aferență senzorială, fără nici o contribuție din partea eferențelor simpatice, care sunt, de fapt, responsabile de o diminuare a extravazării plasmatice (Ferrell și Russell, 1986). Deși eferenții simpatici au fost implicați în dezvoltarea artritei (Aloe și colab., 1992; Bileviciute și colab., 1995; Lubahn și colab., 2004) și în răspândirea inflamației (Levine și colab., 1986) posibila lor contribuție încă nu este clar.

Pentru a rezuma, datele noastre arată că există o corelație neuronală care stă la baza modificărilor inflamatorii contralaterale, manifestată ca activitate antidromică în curs de desfășurare în neuronii senzoriali, care este capabilă să modifice perfuzia articulară contralaterală foarte devreme în timpul bolii. Debutul precoce al modificărilor contralaterale va reprezenta o provocare pentru tratamentul RA, dar constatarea noastră că dipirona analgezică cu acțiune centrală poate reduce activitatea antidromică contralaterală indică faptul că intervenția timpurie cu această clasă de medicamente poate fi utilă în prevenirea răspândirii artritei. Înțelegerea mecanismelor neuronale care stau la baza răspândirii artritei are o relevanță clinică clară, astfel încât să putem încetini progresia acestei boli distructive și debilitante.