Waseem Shahri

Departamentul de Botanică, Universitatea din Kashmir, Srinagar, 190006 India

Inayatullah Tahir

Departamentul de Botanică, Universitatea din Kashmir, Srinagar, 190006 India

Șeicul Tajamul Islam

Departamentul de Botanică, Universitatea din Kashmir, Srinagar, 190006 India

Mushtaq Ahmad Bhat

Departamentul de Botanică, Universitatea din Kashmir, Srinagar, 190006 India

Abstract

Introducere

fiziologice

Plante de Helleborus orientalis în plină înflorire

Materiale și metode

Material vegetal

Au fost folosite flori de Helleborus orientalis care cresc în Grădina Botanică a Universității. Dezvoltarea și senescența florilor a fost împărțită în șase etape pe baza trăsăturilor morfologice distincte (Tabelul 1, Fig. 2a). Aceste etape au fost definite ca stadiu de mugur strâns (I), stadiu de mugur matur (II), stadiu pe jumătate deschis (III), stadiu complet deschis (IV), stadiu parțial verde (V) și stadiu de sepal verde (VI). Modificări vizibile au fost înregistrate pe parcursul dezvoltării și senescenței florilor.

tabelul 1

Diferite caracteristici morfologice pe baza cărora au fost identificate următoarele etape în timpul dezvoltării și senescenței florilor în Helleborus orientalis cv. Olympicus

Etapa de dezvoltare și senescență a florilor Caracteristici
I (Tight mug stage)Mugurii complet inchisi; Sepalele sunt de culoare verzuie
II (stadiul de muguri maturi)Mugurii inchisi; Sepale de culoare cremoasă
III (Etapa pe jumătate deschisă)Flori pe jumătate deschise; Cupa in forma; Toate staminele și nectarele grupate în centru înconjurător pistilii; Pistilele nu sunt vizibile; Flori de culoare alb-crem
IV (etapa complet deschisă)Flori complet deschise; Forma farfurioara; Vârtejuri exterioare de stamine separate de grupul central; Pistile vizibile; Nectarii verzui; Sepale de culoare alb-crem
V (Etapa parțial verde)Flori complet deschise; Forma farfurioara; Verticile exterioare de stamine abscise în timp ce unele verticile interioare înconjoară pistilele; Pistile complet vizibile; Nectarele s-au uscat și s-au transformat în maronii. Inițierea re-ecologizării din porțiunea bazală a sepalelor
VI (Etapa de sepal verde)Flori complet deschise; în formă de farfurie; Toate staminele și nectarele au fost abscise. Pistile verzui mărite la centru care se dezvoltă în foliculi; sepale complet verzi.

A Etapele dezvoltării și senescenței florilor în Helleborus orientalis. Rețineți că în timpul senescenței sepalele devin verzi (Etapele V și VI). b Creșterea dimensiunii pistilului în timpul dezvoltării și senescenței florilor

Diametrul floral, masa proaspătă, masa uscată și permeabilitatea membranei

Diametrul, masa proaspătă și uscată a florilor, precum și sepalele individuale au fost determinate în fiecare etapă. Masa uscată a fost determinată prin uscarea materialului într-un cuptor la 70 ° C timp de 48 de ore. Conținutul de apă a fost determinat ca diferența dintre masa proaspătă și cea uscată. Modificările permeabilității membranei au fost estimate prin măsurarea conductivității electrice (μS) a levigatului a 5 discuri de sepală per floare (5 mm în diametru) perforate din regiunile exterioare ale sepalelor a cinci flori diferite incubate în sticlă de 15 ml apă distilată timp de 15 ore la 20 ° C.

Estimarea zaharurilor, aminoacizilor și fenolilor

În fiecare etapă, 1 g de material tocat din țesutul sepal a fost fixat în etanol fierbinte 80%. Materialul a fost macerat și centrifugat de trei ori. Supernatantele au fost combinate și utilizate pentru măsurarea cantității de zaharuri, aminoacizi și fenoli totali. Zaharurile reducătoare au fost determinate prin metoda lui Nelson (1944) folosind glucoza ca standard. Zaharurile solubile totale au fost estimate după conversia enzimatică a zaharurilor nereducătoare în zaharuri reducătoare cu invertază (BDH). Zaharurile nereducătoare au fost calculate ca diferență între zaharurile totale și cele reducătoare. A-aminoacizii au fost evaluați prin metoda lui Rosen (1957) folosind glicină ca standard. Fenolii totali au fost evaluați prin metoda lui Swain și Hillis (1959) folosind acidul galic ca standard.

Estimarea nivelurilor de proteine ​​și a activității de protează

Proteinele au fost extrase din 1 g de țesut sepal extras separat din diferite flori. Țesutul a fost omogenizat în 5 ml de sulfit de sodiu 5% (g/v) adăugând 0,1 g de polivinilpirolidonă (PVP) și centrifugat. Proteinele au fost precipitate dintr-un volum adecvat de supernatant eliminat cu un volum egal de acid tricloracetic 20% (TCA), centrifugat la 1.000 × g timp de 15 min și peleta redizolvată în NaOH 0,1 N. Proteinele au fost estimate dintr-o alicotă adecvată prin metoda lui Lowry și colab. (1951) utilizând ser albumină serică (BSA) ca standard.

În fiecare etapă, 1 g de țesut sepal pre-refrigerat a fost omogenizat în 15 ml tampon fosfat 0,1 M refrigerat (pH 6,5) într-un pistil și mortar de sticlă pre-răcit. Conținutul a fost stors prin patru straturi de pânză de muselină și centrifugat timp de 15 minute la 5.000 × g într-o centrifugă frigorifică (Remi K-24) la -5 ° C. Supernatantul a fost utilizat pentru testarea activității proteazei prin metoda lui Tayyab și Qamar (1992), cu modificări. Amestecul de reacție a fost 1 ml de BSA 0,1% dizolvat în tampon fosfat 0,1 M (pH 6,5). Reacția a fost oprită prin adăugarea a 2 ml de 20% TCA rece. Blankuri în care s-a adăugat TCA înainte de adăugarea extractului enzimatic au fost rulate împreună cu fiecare probă. Conținutul a fost centrifugat și supernatantele colectate. S-au estimat aminoacizii liberi (ca echivalenți ai tirozinei) într-o alicotă adecvată a supernatantului prin metoda Lowry și colab. (1951) folosind tirosina ca standard. Activitatea enzimatică specifică a fost exprimată ca μg echivalenți de tirozină eliberați pe mg de proteină în extractul de țesut.

SDS-PAGE

În fiecare etapă, 1 g de țesut sepal a fost omogenizat în 1 ml de tampon de extracție (0,1 M pH 7,2) și 100 mg PVP. Amestecul a fost centrifugat la 5.000 × g la -5 ° C într-o centrifugă refrigerată (Remi K-24) timp de 15 min. Supernatantul a fost colectat și utilizat pentru SDS-PAGE. Amestecul de proteine ​​extrase a fost denaturat prin amestecarea volumelor egale de amestec de proteine ​​și tampon de încărcare a probei 2X (0,5 M Tris pH 6,8, 10% SDS, 10% glicerol, 5% β-mercaptoetanol, 0,1% albastru de bromofenol). Amestecul a fost incubat în apă clocotită timp de 5 minute. Concentrația proteinei a fost determinată atât în ​​extractele originale, cât și în probele precipitate TCA prin metoda Lowry și colab. (1951) folosind BSA ca standard.

O electroforeză pe gel verticală dimensională a fost efectuată în conformitate cu metoda descrisă de Ausubel și colab. (1989). Geluri slabe de 0,7 mm grosime conținând 12% gel. 80 pl din extractul de proteină denaturată cu SDS au fost încărcate în fiecare bandă. Electroforeza a fost efectuată la temperatura camerei cu o tensiune constantă de 50 V în timpul stivuirii și 150 V în timpul funcționării. Standardele de greutate moleculară GENEI au fost utilizate pentru a determina greutăți moleculare aproximative (miozină, mușchi de iepure 205.000; fosforilază b 97.400; albumină serică bovină 66.000; ovalbumină 43.000; anhidrază carbonică 29.000; aprotinină 6.500; insulină (lanțuri α și β) 3.000). După electroforeză, gelurile au fost colorate peste noapte în 0,25% albastru strălucitor Coomassie în 45% metanol: 10% acid acetic. Gelurile au fost destinate în 45% metanol: 10% acid acetic, apoi în 7% metanol: 5% acid acetic.

analize statistice

Fiecare valoare reprezentată în tabele corespunde mediei ± S.E de cinci până la zece replici independente.

Rezultate

SDS-PAGE 12% din cantități egale de proteine ​​extractibile în diferite stadii (I-VI) de dezvoltare a florilor și senescență din țesuturile sepale ale Helleborus orientalis. Gelul a fost colorat cu albastru coomassie. Numerele de deasupra benzilor corespund etapelor de dezvoltare. Standardele de greutate moleculară sunt indicate în stânga (kDa) și ca greutăți moleculare ale polipeptidelor majore în dreapta gelului (kDa)

Discuţie

Masa proaspătă și uscată, conținutul de apă și carbohidrații solubili ai florilor, precum și sepalele individuale au arătat o creștere a țesuturilor sepale în timpul procesului de dezvoltare florală de la muguri la floarea complet deschisă, după care s-a constatat o tendință de scădere în timpul senescenței. S-a constatat că scăderea masei proaspete și uscate a florilor se datorează parțial absciziei staminelor și nectarelor și parțial datorită scăderii masei proaspete și uscate a sepalelor individuale. S-a arătat că florile (țesuturile sepale/petale) trec de la a fi o chiuvetă la o sursă în timpul senescenței și modificările precum declinul masei proaspete, a masei uscate și a carbohidraților solubili sunt adesea legate de PCD (Zhou et al. 2005). S-a constatat că maturizarea și senescența florilor sunt însoțite de o scădere a conținutului total de carbohidrați solubili în diferite flori precum garoafe, Hemerocallis, Iris și trandafir (Nichols 1973; Paulin și Jamain 1982; Lukaszewski și Reid 1989; Lay-yee și colab. 1992; Beileski 1993; Mwangi și colab. 2003; Gulzar și colab. 2005; Reid 2005). S-a sugerat că metabolismul zahărului este activ în celulele senescente, deoarece multe schelete de carbon remobilizate din macromolecule sunt transportate din petală, în principal sub formă de zaharoză (van Doorn și Woltering 2008).

În timpul studiului actual, s-a observat că a existat o creștere pronunțată a activității de protează pe măsură ce florile au progresat spre senescență. Activitatea a fost proporțională cu o scădere drastică a proteinelor solubile. Expresia transcrierilor care codifică proteaze este una dintre cele mai vechi modificări ale genelor legate de senescență (Eason și colab. 2002). O creștere semnificativă a activității de protează în timpul senescenței petalelor a fost raportată și la flori precum Hemerocallis, Iris și Petunia (Stephenson și Rubinstein 1998; Pak și van Doorn 2005; Jones și colab. 2005). Prezentul studiu sugerează că, deși nivelurile totale de proteine ​​pot scădea rapid după deschiderea florii, SDS-PAGE a dezvăluit o scădere a proteinelor cu greutate moleculară mai mare, în timp ce conținutul proteinelor cu greutate moleculară mică a crescut. Acest lucru confirmă constatarea similară pe flori precum Hibiscus și Hemerocallis (Woodson și Handa 1987; Courtney și colab. 1994). În acest stadiu nu știm dacă polipeptidele care au crescut în timpul senescenței având o greutate moleculară de aprox. 15,8 și 29,5 kDa joacă un rol important în senescența florilor Helleborus orientalis.