Oxana A. Malakhova

1 Departamentul de Medicină Moleculară și Experimentală, Institutul de Cercetare Scripps, La Jolla, California 92037, SUA; 2 Divizia de Hematologie/Oncologie, Universitatea California din Los Angeles, Facultatea de Medicină, Los Angeles, California 90095, SUA

isgilarea

Ming Yan

1 Departamentul de Medicină Moleculară și Experimentală, Institutul de Cercetare Scripps, La Jolla, California 92037, SUA; 2 Divizia de Hematologie/Oncologie, Universitatea California din Los Angeles, Facultatea de Medicină, Los Angeles, California 90095, SUA

Michael P. Malakhov

1 Departamentul de Medicină Moleculară și Experimentală, Institutul de Cercetare Scripps, La Jolla, California 92037, SUA; 2 Divizia de Hematologie/Oncologie, Universitatea California din Los Angeles, Facultatea de Medicină, Los Angeles, California 90095, SUA

Youzhong Yuan

1 Departamentul de Medicină Moleculară și Experimentală, Institutul de Cercetare Scripps, La Jolla, California 92037, SUA; 2 Divizia de Hematologie/Oncologie, Universitatea California din Los Angeles, Facultatea de Medicină, Los Angeles, California 90095, SUA

Kenneth J. Ritchie

1 Departamentul de Medicină Moleculară și Experimentală, Institutul de Cercetare Scripps, La Jolla, California 92037, SUA; 2 Divizia de Hematologie/Oncologie, Universitatea California din Los Angeles, Facultatea de Medicină, Los Angeles, California 90095, SUA

Keun Il Kim

1 Departamentul de Medicină Moleculară și Experimentală, Institutul de Cercetare Scripps, La Jolla, California 92037, SUA; 2 Divizia de Hematologie/Oncologie, Universitatea California din Los Angeles, Facultatea de Medicină, Los Angeles, California 90095, SUA

Luke F. Peterson

1 Departamentul de Medicină Moleculară și Experimentală, Institutul de Cercetare Scripps, La Jolla, California 92037, SUA; 2 Divizia de Hematologie/Oncologie, Universitatea California din Los Angeles, Facultatea de Medicină, Los Angeles, California 90095, SUA

Ke Shuai

1 Departamentul de Medicină Moleculară și Experimentală, Institutul de Cercetare Scripps, La Jolla, California 92037, SUA; 2 Divizia de Hematologie/Oncologie, Universitatea California din Los Angeles, Facultatea de Medicină, Los Angeles, California 90095, SUA

Dong-Er Zhang

1 Departamentul de Medicină Moleculară și Experimentală, Institutul de Cercetare Scripps, La Jolla, California 92037, SUA; 2 Divizia de Hematologie/Oncologie, Universitatea California din Los Angeles, Facultatea de Medicină, Los Angeles, California 90095, SUA

Abstract

ISG15 este una dintre cele mai puternic induse gene la infecția virală, stimularea interferonului de tip I (IFN) și stimularea lipopolizaharidei (LPS). Aici raportăm că șoarecii lipsiți de UBP43, o protează care elimină ISG15 din proteinele ISGilate, sunt hipersensibili la IFN de tip I. Cel mai important, în celulele cu deficit de UBP43, IFN-β induce o fosforilare prelungită a tirozinei Stat1, legarea ADN și activarea genei mediată de IFN. Mai mult, restaurarea conjugării ISG15 în celulele K562 cu proteine ​​ISGylation-defecte crește activitatea promotorului stimulat de IFN. Aceste descoperiri identifică UBP43 ca un nou regulator negativ al semnalizării IFN și sugerează implicarea ISGilării proteinelor în reglarea căii JAK-STAT.

Interferonii (IFN) sunt modulatori importanți ai funcțiilor imune, inflamatorii și antivirale, precum și supraviețuirea și proliferarea celulelor (Stark și colab. 1998). Ei exercită semnale prin activarea căii JAK-STAT care mediază inducerea rapidă a genelor stimulate de IFN (ISG; Darnell și colab. 1994; O'Shea și colab. 2002). ISG15 (sau UCRP) codifică o proteină de 15 kD care este puternic indusă după tratamentul cu IFN și are o omologie semnificativă a secvenței cu ubiquitina (Blomstrom și colab. 1986; Haas și colab. 1987). ISG15 poate fi, de asemenea, conjugat cu proteine ​​intracelulare printr-o legătură izopeptidază într-un mod similar cu ubiquitina și alți modificatori asemănători cu ubiquitina (ubls), SUMO și Nedd8. Spre deosebire de alte ubluri, ISG15 nu a fost găsit în organismele inferioare, cum ar fi drojdia, nematodele, insectele și plantele, ceea ce indică faptul că poate fi asociat cu funcții specializate la vertebrate. S-a demonstrat că modificarea proteinelor prin ubiquitină, SUMO și Nedd8 joacă roluri importante în diferite funcții celulare, inclusiv reglarea ciclului celular, transducția semnalului, transcrierea și prezentarea antigenului (Hochstrasser 2000; Jentsch și Pyrowolakis 2000; Hicke 2001; Pickart 2001). Cu toate acestea, se știe puțin despre funcția modificării proteinelor prin ISG15 (ISGilare). Mai mult, în ciuda relevanței evidente a rolului său în semnalizarea IFN, această funcție nu a fost explorată.

Rezultate si discutii

Șoarecii UBP43-nuli sunt hipersensibili la puternicul inductor IFN-poli I-C

Injecția cu ARN sintetic dublu catenar, acid poliozininic - acid policitidilic (poliI-C), a fost utilizată în mod obișnuit pentru a induce producția endogenă de IFN la șoareci (Kuhn și colab. 1995). Prin urmare, am folosit poliI-C pentru a evalua diferențele de răspuns ale șoarecilor UBP43 -/- și UBP43 +/+. După injecții zilnice de poliI-C, șoarecii UBP43 +/+ (n = 7) au supraviețuit cursului tratamentului. În schimb, toți șoarecii UBP43 -/- (n = 7) au murit în 72 de ore după tratament (Fig. (Fig. 1A). 1 A). De asemenea, am analizat efectul tratamentului poliI-C asupra celulelor hematopoietice. Așa cum se arată în Figura 1B 1 B și C, șoarecii UBP43 +/+ au răspuns la poliI-C prezentând o scădere cu 20% a numărului de globule albe periferice totale și o scădere cu 30% a celulelor nucleate ale măduvei osoase. Un răspuns mult mai puternic a fost observat la șoareci UBP43 -/-. Au existat scăderi dramatice (> 90%) în numărul total de celule albe din sânge periferic și celule nucleate din măduva osoasă a șoarecilor UBP43 -/-. Aceste rezultate indică faptul că șoarecii cu deficit de UBP43 sunt hipersensibili la poliI-C.

Șoarecii UBP43 -/- sunt hipersensibili la injecția unui puternic inductor IFN, poliI-C. (A) Șapte șoareci din fiecare grup (UBP43 +/+ și UBP43 -/-) au fost injectați intraperitoneal (ip) zilnic cu poliI-C. Viabilitatea a fost monitorizată zilnic. (B) Șoarecii UBP43 +/+ și UBP43 -/- (n = 4 pentru fiecare grup) au fost injectați zilnic ip cu poliI-C. Numărul total de celule albe din sânge (globule albe) din sângele periferic a fost numărat zilnic după fiecare injecție poliI-C. (C) Șoarecii UBP43 +/+ și UBP43 -/- (n = 5 pentru fiecare grup) au fost lăsați netratați sau injectați ip cu poliI-C 24 de ore înainte de extracția măduvei osoase. Celulele măduvei osoase au fost numărate în grupurile martor și injectate poliI-C de șoareci (două femuri de la fiecare șoarece).

Hipersensibilitatea la IFN este intrinsecă în celulele hematopoietice cu deficit de UBP43

Apoptoza crescută a celulelor cu deficit de UBP43 este specifică stimulării IFN de tip I

Rata de apoptoză crescută a celulelor UBP43 -/- este specifică tratamentului IFN de tip I. (A) Celulele măduvei osoase izolate din șoarecii UBP43 +/+ și UBP43 -/- au fost cultivate in vitro în prezența sau absența INF-β (100 unități/ml) timp de 48 de ore. A fost efectuată o analiză TUNEL pentru a studia procentul de celule de apoptoză. (B) Patruzeci și opt de ore după ce celulele măduvei osoase UBP43 -/- au fost infectate cu UBP43-MigR1, au fost cultivate în prezența sau absența INF-β (100 unități/ml) timp de 48 de ore. Celulele (15% EGFP + și 85% EGFP−) au fost colorate cu anexina V-PE și 7-AAD și analizate prin citometrie în flux. (C) Celulele măduvei osoase de la șoareci UBP43 +/− și UBP43 -/- au fost cultivate în absența sau prezența a 10 ng/mL INF-γ, 10 ng/mL TNF-α și 100 unități/mL INF-β pentru 48 h. Celulele au fost apoi supuse unui test de excludere a colorantului albastru Trypan. Fiecare punct de date reprezintă media a trei experimente independente. Barele de eroare reprezintă abaterea standard a mijloacelor.

În experimentul următor am investigat dacă alte citokine proapoptotice ar putea avea un efect similar asupra celulelor UBP43 -/-. TNF-α și IFN de tip II, IFN-γ sunt utilizate în mod obișnuit pentru a studia creșterea celulelor măduvei osoase și apoptoza și în analiza diferitelor modele de șoareci knockout. Prin urmare, am efectuat teste lichide de cultură a celulei măduvei osoase pentru a studia efectul TNF-α, IFN-γ și IFN-β asupra celulelor UBP43 +/− și UBP43 -/-. După cum era de așteptat, tratamentul cu IFN-β a dus la o creștere substanțială a apoptozei în celulele UBP43 -/-, în timp ce IFN-γ și TNF-α nu au cauzat o diferență semnificativă în moartea celulară între celulele UBP43 +/− și celulele UBP43 -/- (Fig. (Fig.3C) .3 C). Acest rezultat indică un rol specific al IFN de tip I în inducerea apoptozei în celulele cu deficit de UBP43.

Semnalizarea JAK-STAT este activă pe scară largă în celulele UBP43-nule la stimularea IFN

Calea JAK-STAT este activă extensiv în celulele UBP43 -/- după stimularea IFN. (A) Formarea complexului ISGF3 în celule cu deficit de UBP43 la stimularea IFN-β. UBP43 +/+ și UBP43 -/- celulele măduvei osoase au fost lăsate netratate sau stimulate pentru timpul indicat. Extractele totale de proteine ​​(30 μg) au fost utilizate în testele de schimbare a gelului cu 32 oligonucleotide dublu catenare marcate cu P care conține un situs de legare ISGF3. (B) UBP43 +/+ și UBP43 -/- celulele măduvei osoase au fost lăsate netratate sau stimulate cu 100 unități/ml IFN-β așa cum s-a descris mai sus. Proteinele totale (15 μg) au fost rezolvate pe 7% SDS-PAGE și imunoblotate cu anti-fosfo-Stat1 (Tyr701) Abs. Bloturile au fost dezbrăcate și reprobate cu abs anti-Stat1 pentru a asigura o încărcare egală. (C) Inducerea ISG în celulele măduvei osoase UBP43 +/+ și UBP43 - /. Analiza Northern blot a expresiei genei ISG15, 2'-5'OAS și IRF7 a fost efectuată pe ARN total izolat din celule de măduvă osoasă UBP43 +/+ și UBP43 -/- tratate cu 100 de unități/ml de IFN-β pentru timpul indicat.

ISGilarea proteinelor îmbunătățește semnalizarea IFN

ISGilarea proteinelor crește semnalizarea IFN. (A) expresia funcțională UBE1L restabilește ISGilarea proteinei în celulele K562. Controlul sau plasmida de expresie UBE1L pcDNA-HA-UBE1L celule K562 transfectate tranzitoriu au fost cultivate în absența sau prezența a 1000 unități/ml IFN-α timp de 24 de ore. Extractele de proteine ​​au fost preparate din aceste celule și utilizate în analiza Western blot cu anticorpi împotriva ISG15 (panoul superior) și eticheta HA (panoul inferior). Expresia clară UBE1L poate fi detectată în celulele transfectate. Asteriscurile marchează mai multe benzi de semnal nespecifice. Pozițiile markerilor de greutate moleculară sunt prezentate în partea stângă. (B) Celulele K562 au fost transfectate tranzitoriu cu p3K-UBP43-luc și fie vector pcDNA, fie expresia UBE1L construiesc pcDNA-HA-UBE1L cu ​​expresia Renilla luciferază construiesc pRL-nul pentru controlul eficienței transfecției. Celulele au fost cultivate în prezența sau absența a 1000 unități/ml IFN-α pentru timpul indicat și recoltate pentru un test dual de luciferază. Activitatea promotorului este prezentată ca activitate relativă de luciferază cu licurici, care a fost normalizată la activitatea de luciferază Renilla. Activitatea medie a promotorului a fost generată din patru experimente separate. Barele de eroare reprezintă abaterea standard a mediei.

Materiale și metode

Injecție PolyI-C și numărarea celulelor hematopoietice

PoliI-C (Sigma) a fost dizolvat în soluție salină tamponată cu fosfat și injectat intraperitoneal la șoareci la 5 μg/g greutate corporală (gbw). Sângele și celulele nucleate ale măduvei osoase au fost numărate în soluția Türk (3% acid acetic și 0,01% cristal violet în H2O).

Transplant de măduvă osoasă

Celulele măduvei osoase (CD45.2 +) au fost colectate de la șoareci donatori UBP43 +/+ și UBP43 -/- 5 zile după ce au fost injectați cu 5-fluorouracil (5-FU; Sigma) la 100 μg/gbw. Șoarecii receptor C57/BL6 congenici C57/B6.SJL PEP3b-BoyJ (CD45.2−) au fost iradiați letal (1000 rads într-o doză divizată separată de 4 h) folosind un iradiator Gamma (J.L. Shepherd Model 143-45). Un total de 1 × 106 celule de măduvă osoasă de la fiecare șoarece donator individual au fost injectate intravenos în fiecare primitor iradiat. Șoarecii transplantați au fost păstrați în cuști sterilizate și hrăniți cu apă acidă (pH 2,0) timp de 3 săptămâni înainte de a reveni la îngrijirea regulată. Apariția celulelor sanguine de origine a donatorului (CD45.2 +) a fost detectată prin analiza citometrică de flux cu anticorpi CD45.2 cu izotiocianat de fluorescență (FITC) (BD Biosciences).

Cultură de celule de măduvă osoasă in vitro

Testul unității de formare a coloniei (CFU) a fost efectuat așa cum a fost descris anterior în prezența concentrației indicate de IFN-β (Calbiochem; Rhoades și colab. 2000). Cultura lichidă a celulelor măduvei osoase a fost efectuată în RPMI 1640 cu 10% ser fetal bovin, 10 ng/ml IL-3 (Peprotech), 10 ng/ml IL-6 (Peprotech) și 100 ng/mL SCF (Peprotech) în prezența sau absența a 100 unități/mL IFN-β, 10 ng/mL IFN-γ (Peprotech) sau 10 ng/mL TNF-α (Calbiochem).

Testul apoptozei

Testul TUNEL a fost efectuat conform instrucțiunilor producătorului (Boehringer Mannheim). Un număr total de 200 de celule au fost numărate pentru a determina procentul de celule apoptotice. Un test de apoptoză anexină V-PE/7-AAD (7-amino-actinomicină D) a fost efectuat folosind un kit de detectare a apoptozei conform instrucțiunilor producătorului (BD PharMingen).

Infecție retrovirală

ADNc UBP43 a fost subclonat în siturile Bgl II și Hap I ale MigR1. Producerea stocului de retrovirus deficient de replicare și a infecției cu celule ale măduvei osoase a fost efectuată așa cum s-a descris (Pear și colab. 1998).

Test de schimbare a gelului

Testele au fost efectuate așa cum s-a descris (Malakhova și colab. 2002). Oligonucleotida bicatenară din promotorul ISG15 care conține un situs de legare ISGF3 a fost utilizată în test (Fu și colab. 1990).

Construcția și transfecția plasmidei

ADNc UBE1L a fost furnizat cu amabilitate de Dr. Charles Buys (Kok și colab. 1993) și subclonat în pcDNA3 conținând o secvență de etichetă HA de capăt 5 'generând pcDNA-HA-UBE1L. Constructorul promotor-luciferază UBP43 p3K-UBP43-luc a fost descris anterior (Malakhova și colab. 2002). Transfecția celulelor K562 a fost efectuată cu electroporare (220 V, 975 μF). Un total de 1 × 107 celule K562 au fost transfectate cu p3K-UBP43-luc (4 μg), pcDNA3 sau pcDNA-HA-UBE1L (6 μg) și construirea pRL-luc (200 ng) de Renilla luciferază fără promotor ca control intern pentru eficiența transfecției. La douăzeci și patru de ore după electroporare, celulele au fost împărțite în două baloane și cultivate în prezența sau absența a 1000 unități/ml IFN-a pentru durata de timp indicată. Activitățile luciferazei au fost analizate folosind sistemul de testare dual-luciferază (Promega).

Western blot

Anticorpii împotriva phospho-Stat1Tyr701 (Cell Signaling), Stat1 (Santa Cruz) și HA (Babco) au fost cumpărați de la producătorii respectivi. Anticorpii policlonali ISG15 anti-șoarece de iepure au fost generați utilizând șoarece ISG15 de lungime completă. Anticorpii policlonali de iepure împotriva ISG15 uman au fost furnizați cu generozitate de Dr. E. Borden (D'Cunha et al. 1996). Western blot a fost efectuat așa cum este descris (Malakhov și colab. 2002).

Northern blotting

ARN-ul total a fost izolat utilizând reactivul RNazol B conform instrucțiunilor producătorului (TEL-TEST). Zece micrograme de ARN total din fiecare probă au fost separate într-un gel de agaroză/formaldehidă (0,22 M), șters pe membrana Hybond N + (Amersham) și testate cu 32 de ADNc marcate cu P.

Mulțumiri

Mulțumim lui Ernest Beutler, Juan Carlos de la Torre și Herbert Virgin pentru lectura critică a manuscrisului. Această lucrare a fost susținută de subvenții de la NIH și American Cancer Society. K.J.R. este bursier postdoctoral Skaggs. D.E.Z. este cercetător al Societății de Leucemie și Limfom. Fondul de înzestrare Stein a sprijinit parțial Laboratorul Serviciului Departamental de Biologie Moleculară pentru Secvențierea ADN și Sinteza Oligonucleotidelor. Acesta este manuscrisul 15054-MEM de la Scripps Research Institute.

Costurile de publicare ale acestui articol au fost suportate parțial prin plata taxelor de pagină. Prin urmare, acest articol trebuie marcat „publicitate” în conformitate cu secțiunea 1734 din 18 USC numai pentru a indica acest fapt.