A. Dellarupe

1 Laborator de imunoparazitologie, Facultatea de Științe Veterinare, Universitatea Națională din La Plata, 60 și 118, 1900 La Plata, Argentina

2 Consiliul Național pentru Investiții Științifice și Tehnice (CONICET), Buenos Aires, Argentina

J.M. Unzaga

1 Laborator de imunoparazitologie, Facultatea de Științe Veterinare, Universitatea Națională din La Plata, 60 și 118, 1900 La Plata, Argentina

Domnul More

1 Laborator de imunoparazitologie, Facultatea de Științe Veterinare, Universitatea Națională din La Plata, 60 și 118, 1900 La Plata, Argentina

2 Consiliul Național pentru Investiții Științifice și Tehnice (CONICET), Buenos Aires, Argentina

M. Kienast

3 Institutul de Genetică Veterinară (IGEVET), CCT La Plata, CONICET, Facultatea de Științe Veterinare, Universitatea Națională din La Plata, La Plata, Argentina

A. Larsen

4 Departamentul de Imunologie Veterinară, Facultatea de Științe Veterinare, Universitatea Națională La Plata, La Plata, Argentina

C. Stiebel

5 Dpto. Zoonosis, Municipalidal Gral. San Martín, Prov. de Buenos Aires, Hotel Argentina

M. Rambeaud

1 Laborator de imunoparazitologie, Facultatea de Științe Veterinare, Universitatea Națională din La Plata, 60 și 118, 1900 La Plata, Argentina

2 Consiliul Național pentru Investiții Științifice și Tehnice (CONICET), Buenos Aires, Argentina

M.C. Venturini

1 Laborator de imunoparazitologie, Facultatea de Științe Veterinare, Universitatea Națională din La Plata, 60 și 118, 1900 La Plata, Argentina

Abstract

Criptosporidioza se observă la reptile cu morbiditate ridicată și mortalitate considerabilă. Obiectivul acestui studiu a fost de a realiza identificarea moleculară a Cryptosporidium spp. în geckos leopard de companie (Eublepharis macularius) dintr-o colonie de reproducători din Buenos Aires, Argentina. Oochisturi comparabile cu cele ale Cryptosporidium spp. au fost detectate la trei geckos cu antecedente de diaree, anorexie și cașexie. Metodele de identificare moleculară au confirmat prezența Cryptosporidium varanii (syn. C. saurophilum). Acest agent a fost considerat a fi cauza principală a bolii clinice observate. Aceasta este prima descriere a infecției cu C. varanii la reptilele animalelor de companie din Argentina.

Introducere

Reptilele devin animale de companie populare în întreaga lume; cu toate acestea, se știe puțin despre prezența și controlul criptosporidiozei la această populație de animale. În ultimii ani, criptosporidioza a cauzat pierderi economice importante pentru crescătorii de reptile comerciale. Prin urmare, obiectivul acestui studiu a fost de a efectua caracterizarea moleculară a Cryptosporidium spp. din geckos leopard infectat natural (Eublepharis macularius) în Argentina.

Materiale și metode

Animale și probe

O probă de scaun colectată de la 3 geckos leopard (E. macularius) a fost colectată și trimisă la Universitatea La Plata pentru studii moleculare. Trei geckos (două femele și 1 bărbat) (Fig. 1) au fost primiți de către medicii veterinari dintr-o colonie de crescători din Buenos Aires, Argentina cu antecedente de diaree, anorexie și cașexie. Probele fecale au fost plasate mai întâi într-un tub de 15 ml. Tubul a fost parțial umplut cu soluție de zaharoză și amestecat într-un vortex timp de aproximativ 5 sec. fiecare tub a fost centrifugat la 252 g timp de 10 min. O alicotă a fost luată de la suprafață și răspândită pe o lamă și examinată pentru prezența Cryptosporidium spp. oochisturi prin microscopie cu lumină (Deming și colab., 2008). Pata modificată Ziehl-Neelsen pentru frotiurile fecale a fost efectuată în esență așa cum s-a descris anterior (Henriksen și Pohlenz, 1981); au fost evidențiate câteva oociste rotunde de 4-5 um în diametru compatibile cu Cryptosporidium spp. (Fig. 2). Eșantionul colectat a fost supus unei tehnici de flotație a zahărului (soluție de zaharoză fără formaldehidă) și sedimentare a apei așa cum s-a descris anterior pentru concentrația de oocisti coccidieni (Ortega-Mora și colab., 2007). Oochisturile concentrate au fost resuspendate în 450 ofl de apă fără nuclează.

varanii

Trei geckos leopard (două femele și 1 bărbat) primite de medicii veterinari dintr-o colonie de reproducători din Buenos Aires, Argentina cu antecedente de diaree, anorexie și cașexie

Frotiu fecal al geckosului leopard (tehnica Ziehl-Neelsen modificată): oociste rotunde cu diametrul de 4-5 diametri compatibile cu Cryptosporidium spp.

Extracția ADN-ului

Întreruperea ovocistului și purificarea ADN-ului din proba fecală (procesată în triplicat) a fost efectuată cu un kit comercial de scaun ADN (QIAamp DNA Stool Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germania) conform recomandărilor producătorului. O probă de control al procesului (soluții de kit de extracție și 150 ofl de apă fără nuclează) a fost evaluată împreună cu probele de scaun.

Identificarea moleculară

O tehnică PCR imbricată a fost realizată pentru amplificarea unui fragment polimorf al genei 18S rDNA (Xiao și colab., 1999). Cinci alicote alilice ale produselor PCR interne au fost examinate prin electroforeză în geluri de agaroză 1% și colorate cu bromură de etidiu. Doi dintre ampliconii obținuți (care ating o concentrație estimată de gel de aproximativ 40 ng/pl), au fost purificați folosind polietilen glicol și secvențiat în ambele direcții folosind secvențierea Megabace 1000 (GE Health care) la IGEVET, FCV, UNLP. Secvențele au fost aliniate și analizate folosind software-ul GENEIOUS (versiunea gratuită disponibilă 7.1, http://www.geneious.com). Secvențele consensuale obținute au fost comparate cu altele publicate în GenBank prin analiza megastast BLASTn.

Rezultate si discutii

Reptilele au devenit animale de companie populare în întreaga lume în ultimii ani. Gecko leopardul este o șopârlă crepusculară care se găsește la sol, găsită în mod natural în deșerturile din Asia și în tot Pakistanul, în partea de nord-vest a Indiei (Henkel și colab., 1995).

După ingestia Cryptosporidium spp. oochisturi de către gazdă, sporozoizii sunt eliberați și invadează celulele epiteliale. Protozoarii se înmulțesc asexual și sexual provocând moartea celulelor gazdă. Cryptosporidium spp. infecția este asociată cu leziuni hiperplazice și inflamatorii ale tractului gastro-intestinal la diferite specii de animale, inclusiv geckos (Terrell și colab., 2003). Astfel, Criptosporidioza a fost asociată cu un sindrom de irosire sau „lumină ușoară” la geckos leopard, caracterizat prin scădere cronică în greutate, diaree, letargie, urmată de anorexie și deces (Deming și colab., 2008). În studiul de față, trei geckos leopard dintr-o colonie de reproducători din Argentina au prezentat un sindrom de irosire și oocisti compatibili cu Cryptosporidium spp. au fost detectate prin colorarea Ziehl-Neelsen. Studiile anterioare evidențiază importanța metodelor de diagnostic molecular pentru a identifica nivelurile speciilor din genul Cryptosporidium (Richter și colab., 2011). În Spania, Pedraza-Diaz și colab. (2009) au efectuat PCR și secvențierea de la șapte probe de scaun geckos leopard cu Cryptosporidium spp. oochisturi, identificând C. varanii (n = 3), C. serpentis (n = 2) și C. parvum (n = 2). Un studiu similar efectuat în Austria a detectat C. varanii și C. serpentis (32/74 și respectiv 8/74 geckos leopard) (Richter și colab., 2011).

În studiul de față, identificarea moleculară a Cryptosporidium spp. a fost efectuată prin secvențierea unui fragment polimorf al genei ARNr din anii 18. PCR imbricat a fost pozitiv (toate cele 3 replici), evidențiind un produs de aproximativ 830 bp. O secvență consensuală de 748 pb a fost obținută și înregistrată pe GenBank sub numărul de acces> KM610237. Această secvență a fost comparată cu altele publicate în GenBank prin analiza megastast BLASTn și a relevat o identitate de secvență de 99% cu C. saurophilum (GenBank> EU553551,> EU553552 și> EF502042) din geckos leopard asimptomatic (E. macularius) și un șarpe (Boa constrictor ) în Spania (Pedraza-Diaz și colab., 2009) și de la un șarpe adult simptomatic (Elaphe guttata guttata) dintr-o colonie privată de reproducere a șerpilor din Japonia (Plutzer și Karanis, 2007), respectiv. Secvența a evidențiat identitate similară (99%) cu C. varanii (GenBank> KJ000485) de la un șarpe adult asimptomatic (Pantherophis guttatus) din serpentariul Institutului Butantan din São Paulo, Brazilia (da Silva și colab., 2014) și Cryptosporidium spp. de la un monitor de deșert (GenBank> AF112573) din Missouri, SUA (Xiao și colab., 1999).

C. varanii a fost numită inițial în 1995 de Pavlásek și colab. (1995) pentru a descrie oochisturile obținute de la un monitor Emerald (Varanus prasinus) în grădina zoologică din Praga. Descrierea s-a bazat pe morfologia oocistului, histologia etapelor endogene din intestin și eșecul infectării șoarecilor. Aceeași specie a fost identificată ulterior la alte șopârle și la șerpi (Pavlasek și Ryan, 2008). Nomenclatura lui C. saurophilum a fost utilizată în 1998 de Koudela și Modry (1998) pentru oochisturile obținute dintr-o schneider (Eumeces schneideri). Comparația moleculară dintre C. saurophilum și C. varanii la locurile ARNr 18S și locină a arătat că sunt identice genetic, dar așa cum C. varanii a fost descris anterior, are prioritate față de C. saurophilum care ar trebui considerat un sinonim junior al C. varanii (Pavlasek și Ryan, 2008; Xiao și colab., 2004b). Luând în considerare studiile anterioare, protozoarele detectate de la geckos leopard din Argentina au fost identificate ca C. varanii (syn. C. saurophilum).

Cryptosporidium spp. obținut de la un monitor de deșert a fost raportat inițial de Xiao și colab. (1999). Din punct de vedere morfologic, oochisturile Cryptosporidium spp. genotipul monitorului deșertului a fost foarte asemănător cu cel al C. varanii ca formă și dimensiune și semnificativ mai mici decât oocistele C. serpentis. Caracterizările moleculare și biologice efectuate în studii ulterioare au identificat parazitul ca fiind C. saurophilum (Xiao și colab., 2004b). Acest lucru ar putea explica de ce secvența obținută în prezentul studiu a evidențiat omologie de 99% cu secvența GenBank> AF112573 (Xiao și colab., 1999). Numele secvențelor raportate în GenBank ar trebui revizuite pentru a evita alte interpretări greșite.

Acesta este primul raport de caz și identificarea moleculară a C. varanii la geckos leopard din Argentina. Chiar dacă nu a fost posibil să se stabilească dacă toate cele trei animale au fost infectate cu C. varanii, deoarece o probă colectată a fost primită în laborator, este posibil să presupunem că toate animalele au fost infectate cu C. varanii, deoarece toate au evidențiat semne clinice similare compatibile cu criptosporidioză. Ar trebui efectuate studii suplimentare pentru a identifica prevalența și implicațiile criptosporidiozei la șopârlele de animale din Argentina, pentru a genera conștientizare în rândul crescătorilor comerciali, proprietari de animale de companie și practicienilor clinici din Argentina. Studiul de față a evidențiat existența criptosporidiozei clinice la geckosii de leopard captivi din Argentina și subliniază importanța identificării moleculare la nivelul speciilor de oocisturi asemănătoare Cryptosporidium spp. Găsite în probele fecale.

Conflict de interese

Autorii declară că nu există niciun conflict de interese.

Mulțumiri

Mulțumim cu recunoștință sprijinul tehnic al lui Isidoro Ercoli.