Abstract

  • CHOP, proteină omologă C/EBP
  • eIF2α, factorul de inițiere a traducerii eucariote 2α
  • ER, reticul endoplasmatic
  • GRP78, proteină reglată de glucoză, 78 kD
  • HIF1, factor inductibil de hipoxie-1
  • IRE1, proteină-1 care necesită inozitol
  • MMP2, metaloproteinaza matricială 2
  • PAI-1, inhibitor activator plasminogen tip 1
  • PPAR, proliferator de peroxizom - receptor activat
  • ARNsi, ARN interferent mic
  • UPR, răspuns proteic desfășurat
  • WAT, țesut adipos alb
  • XBP1, proteina-1 de legare a cutiei X.

Studii recente au arătat că țesutul adipos nu este doar un rezervor pasiv pentru stocarea energiei, ci produce și secretă o varietate de molecule bioactive numite adipocitokine, inclusiv factor de necroză tumorală, leptină, rezistină și inhibitor de activare a plasminogenului de tip 1 (PAI-1) 1 –4). Producția neregulată de adipocitokine este asociată cu fiziopatologia bolilor metabolice legate de obezitate (5-9). Am identificat adiponectina ca o adipocitokină în biblioteca de ADNc a țesutului adipos uman (10). Nivelurile de adiponectină plasmatică sunt scăzute în ceea ce privește obezitatea și diabetul de tip 2 (11,12). Funcțiile biologice ale adiponectinei includ îmbunătățirea metabolismului glucozei și a lipidelor (4) și prevenirea inflamației și aterosclerozei (13-15). Adiponectina este privită ca o legătură între obezitate și tulburările metabolice. Cu toate acestea, mecanismele precise responsabile de dereglarea adiponectinei nu au fost complet elucidate.

țesutului

Obezitatea ca exces de țesut adipos este atribuită hipertrofiei și hiperplaziei adipocitelor. Adipocitele devin hipertrofice în timpul dezvoltării obezității, iar dimensiunea lor crește până la 140-180 μm în diametru (16). Adipocitele au o capacitate limitată de hipertrofie; un motiv pentru aceasta este considerat limita de difuzie a oxigenului, care este de cel mult 100 μm (17). Prin urmare, este posibil ca adipocitele hipertrofice să reziste la un aport de oxigen mai mic decât adecvat.

Studii recente au raportat că stresul ER este crescut la nivelul ficatului și țesutului adipos al șoarecilor obezi (23,24). Diversi stimuli intracelulari și extracelulari, inclusiv privarea de glucoză sau nutrienți, hipoxia, infecția virală și sinteza crescută a proteinelor secretoare pot declanșa stresul ER (21). Cu toate acestea, factorii declanșatori care induc stresul ER în obezitate au rămas neclare.

În studiul de față, oferim dovezi pentru hipoxia în țesutul adipos al șoarecilor obezi și că o astfel de hipoxie se datorează parțial unui aport inadecvat de sânge. În plus, am constatat că expunerea adipocitelor la hipoxie determină producția neregulată de adipocitokine și că reglarea descendentă a ARNm a adiponectinei indusă de hipoxie este mediată de mecanisme transcripționale dependente de stresul ER și - mecanisme posttranscripționale independente.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII

Toate animalele au fost achiziționate de la CLEA Japonia, au fost adăpostite într-o cameră sub temperatură controlată (23 ± 1 ° C) și umiditate (45-65%) și au avut acces gratuit la apă și chow (Oriental Yeast Co.). Am folosit șoareci masculi pentru dieta bogată în grăsimi - studiu de hrănire și șoareci femele pentru studiul șoareci KKAy. Pentru studiile obezității induse de dietă, șoarecii masculi C57BL/6J au fost împărțiți la întâmplare în două grupuri la vârsta de 8 săptămâni. Primul grup a fost hrănit cu o dietă bogată în grăsimi conținând 30% grăsimi în greutate (AIN93G), în timp ce al doilea grup a fost hrănit cu un chow normal conținând 5,9% grăsimi în greutate (CRF-1; Oriental Yeast Co.) timp de 8 săptămâni. Șoarecii normali hrăniți și hrăniți cu conținut ridicat de grăsimi au fost uciși la vârsta de 16 săptămâni, iar femelele C57BL/6J și șoarecii femele KKAy au fost uciși la vârsta de 10-11 săptămâni. Țesuturile au fost disecate și congelate în azot lichid. Probele au fost depozitate la -80 ° C până la utilizare. Pentru analiza gazelor arteriale din sânge, probele de sânge au fost colectate din artera carotidă stângă și măsurate cu ajutorul unui analizor de sânge (i-STAT; Fuso Pharmaceutical Industries, Tokyo, Japonia).

Detectarea hipoxiei.

Un kit Hypoxyprobe-1 Plus (Chemicon International, Temecula, CA) a fost utilizat pentru detectarea hipoxiei tisulare. Șoarecii au fost injectați cu 40 mg/kg pimonidazol intraperitoneal cu 1 oră înainte de a fi uciși. Organele au fost îndepărtate imediat, fixate în 10% formalină tamponată neutră timp de 24-48 ore și apoi prelucrate în blocuri de parafină. Secțiunile au fost pregătite conform instrucțiunilor furnizate de producător, contracolorate cu hematoxilină și analizate în mod standard.

Cuantificarea capacității de perfuzie cu ajutorul microsferelor.

Șoarecii au fost anesteziați prin injecție intraperitoneală de pentobarbital și un cateter de polietilenă a fost poziționat în arcul aortic prin artera carotidă stângă. Microsfere colorante galbene (15,5 μm diametru, 4 × 10 4 margele; Triton Technology, San Diego, CA) au fost injectate și apoi spălate cu soluție salină. Țesuturile au fost dizolvate în KOH de 4 mol/l și filtrate cu filtre cu membrană din poliester (Triton Technology). Vopseaua fluorescentă a fost extrasă cu acetat de celuloză acidificat, iar fluorescența a fost măsurată cu un cititor de plăci și normalizată prin greutatea fiecărui țesut.

Concentrația de lactat.

Concentrațiile de lactat tisular au fost determinate cu un kit de testare folosind instrucțiunile furnizate de producător (Roche, Mannheim, Germania) și normalizate prin concentrația de proteine. Proteinele au fost cuantificate prin metoda acidului bicinconinic utilizând reactivul de testare a proteinei BCA obținut de la Pierce (Rockford, IL) și BSA ca standard.

Cultură de celule.

Preadipocitele 3T3-L1 au fost crescute până la confluență și induse să se diferențieze în adipocite, așa cum s-a descris anterior (25). Celulele au fost apoi cultivate timp de 12 ore sub hipoxie (1% O2) sau normoxie (21% O2).

PCR cantitativ în timp real.

Analiza îmbinării proteinei-1 mRNA de legare a cutiei X indusă de hipoxie.

ARN-ul total din celulele 3T3-L1 cultivate în hipoxie (1% O2) a fost transcris invers și amplificat folosind primerul de sens (5'-AAACAGAGTAGCAGCGCAGACTGC-3 ') și primerul antisens (5'-GGATCTCTAAAACTAGAGGCTTGGTG-3'). Acest fragment a fost digerat în continuare de PstI așa cum s-a descris anterior (26). Fragmentele de ADNc au fost rezolvate pe un gel de agaroză 2%.

Plasmide.

Plasmidele raportoare de luciferază ale promotorului adiponectinei umane au fost generate prin excizia fragmentului promotor din clona genomică a adiponectinei (dar generos de la Dr. Junji Takeda) și inserarea acestuia în site-urile KpnI și SacI ale vectorului de exprimare a luciferazei de bază pGL3 (Promega, Madison, WI). Plasmidele de expresie care codifică β-galactozidaza (pCMX - β-gal) au fost daruri generoase de la Dr. David Mangelsdorf (Centrul Medical Southwestern al Universității din Texas, Dallas, TX). Mouse CHOP (numărul de acces BC013718) a fost clonat și introdus în pCMV pentru a genera plasmida de expresie pentru mouse CHOP (pCMV-CHOP).

Determinarea activității transcripționale a adiponectinei în celulele 3T3-L1.

În ziua 5 după inducerea diferențierii, mediul celulelor 3T3-L1 în plăci cu șase godeuri a fost schimbat în OPTI-MEM (Invitrogen, San Diego, CA), iar celulele au fost transfectate cu plasmide folosind reactivul LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) conform la instrucțiunile furnizate de producător. La 48 de ore după transfecția plasmidei, testele de raportare a luciferazei au fost efectuate utilizând sistemul de testare a luciferazei (Promega). Valorile luciferazei au fost normalizate printr-un control al β-galactozidazei interne și exprimate ca activitate relativă a luciferazei.

Western blot.

Analiza Western blot a fost efectuată folosind anticorpi anti-eIF2α (factor de inițiere a traducerii eucariote 2α) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

Proiectarea și transfecția ARN-urilor mici care interferează.

Două perechi de ARN-uri interferente mici (ARNsi) au fost sintetizate chimic de către Qiagen, recocite și transfectate în adipocite 3T3-L1 folosind Lipofectamina 2000 (Invitrogen) așa cum a fost descris anterior (27). Douăzeci și patru de ore după transfecție, celulele au fost cultivate timp de 12 ore sub hipoxie (1% O2) și ARN total extras așa cum s-a descris mai sus.

Analiza statistică și considerații etice.

Toate datele sunt prezentate ca mijloace ± SEM și analizate folosind testul t al Studentului nepereche. Pentru comparații multiple simultane, diferențele dintre grupuri au fost analizate prin ANOVA unidirecțional, urmată de testul de comparații multiple Dunnet. Valorile P 15 O] apă marcată (44) și metoda de spălare 133 Xe (45) și au fost mai mici la obezi comparativ cu subiecții nonobezi. Aceste rapoarte sunt în concordanță cu datele actuale, sugerând că o scădere a perfuziei țesutului adipos este o caracteristică comună în obezitate. Am măsurat numărul de nuclei de celule endoteliale și adipocite pe secțiuni de WAT în control, dietă bogată în grăsimi - hrănite și șoareci KKAy. Raportul numărului de celule endoteliale per adipocit a crescut semnificativ la obezi comparativ cu șoarecii martor (datele nu sunt prezentate). Având în vedere aceste rezultate, fluxul de sânge pe vase poate scădea grav în WAT la șoareci obezi.

Având în vedere că difuzia oxigenului este limitată la cel mult 100 μm, se presupune că adipocitele hipertrofiate cu diametrul de până la 140-180 μm sunt într-o stare relativ hipoxică. Cu toate acestea, în studiul nostru, colorarea pimonidazolului a fost detectată atât la adipocitele mici, cât și la cele mari de animale obeze. Aceste rezultate sugerează că capacitatea redusă de perfuzie, mai degrabă decât dimensiunea celulei, pare să fie principalul vinovat pentru hipoxia tisulară.

Am evaluat efectul hipoxiei asupra expresiei adipocitokinei. Nivelurile de expresie ale ARNm ale adiponectinei și PPARγ au fost reduse în timp ce nivelul PAI-1 a crescut în adipocitele 3T3L1 hipoxice. În plus, hipoxia a scăzut activitatea promotorului adiponectinei, sugerând un efect supresiv al hipoxiei asupra transcrierii adiponectinei.

Reglarea posttranscripțională a stabilității ARNm este un alt control al expresiei genelor prin hipoxie, așa cum se arată în mai multe gene reglate de hipoxie, inclusiv factorul de creștere endotelial vascular, tirozin hidroxilaza, GLUT1, eritropoietina și NO sintetaza endotelială (50,51). În studiul nostru, hipoxia a crescut degradarea ARNm a adiponectinei în adipocite și acest efect a fost independent de stresul ER. ARNm de adiponectină, totuși, nu conține motive clasice bogate în AU pentru stabilitatea ARNm (52), sugerând motive de secvență necunoscute implicate în stabilitatea sa. Aceste date indică faptul că transcripția ARNm a adiponectinei a fost reglată prin stres ER și că stabilitatea ARNm a fost reglată posttranscripțional prin hipoxie.

Alte mecanisme ar putea fi, de asemenea, implicate în reglarea descendentă indusă de hipoxie a ARNm-ului adiponectinei, cum ar fi HIF1α, ROS, redox și inflamație. Reglarea descendentă a ARNm adiponectinei indusă de hipoxie nu a fost afectată de ARNsi HIF1α, prin urmare suprimarea expresiei adiponectinei indusă de hipoxie nu ar trebui să fie dependentă de HIF1α. De asemenea, am testat efectele mai multor antioxidanți, cum ar fi N-acetil-cisteina, hidroxianisolul butilat, apocinina, catalaza și agenții care modifică starea redox celulară afectând raportul NAD (P) H-NAD (P), adică rotenona (un inhibitor al complexului I [NADH-dehidrogenază] al lanțului respirator) și al lactatului (un produs al metabolismului energiei anaerobe, care induce o creștere a raportului NAD (P) H/NAD (P) în timp ce se oxidează la piruvat) și inhibitori ai protein kinazei, cum ar fi SB203580 (un inhibitor p38MAPK), LY294002 (un inhibitor PI3K), PD98059 (un inhibitor MEK) și SP600125 (un inhibitor JNK). Niciunul dintre ei nu a atenuat reglarea descendentă a expresiei ARNm adiponectin indusă de hipoxie. Aceste dovezi pot exclude rolurile ROS, redox și inflamație în producția redusă de adiponectină în adipocitele hipoxice.

Pe scurt, am demonstrat că WAT al șoarecilor obezi este hipoxic și că hipoxia disregulează producția de adipocitokine în adipocite. Acest efect este mediat de stresul ER și reglarea posttranscripțională. În mod colectiv, rezultatele noastre sugerează că hipoxia țesutului adipos local este parțial responsabilă pentru producția de adipocitokine neregulată și sindromul metabolic la obezitate. Hipoxia, în sine, precum și semnalele mediate de hipoxie, ar putea deveni o țintă terapeutică pentru tratamentul sindromului metabolic legat de obezitate.

Detectarea hipoxiei WAT epididimale sau parametrice prin imunohistochimie pentru aductii de proteine ​​pimonidazol. Secțiunile de WAT au fost colorate cu un anticorp specific pentru aductele pimonidazolului (culoare maro) și hematoxilină și examinate microscopic. A: WAT de la șoareci alimentați cu dietă normală (control) și dietă bogată în grăsimi (IC). B: WAT de la șoarecii C57BL6J (control) și KKAy (KKAy). Mărire originală × 200.