ANUNȚ. și J.T. a contribuit în mod egal la acest studiu.

uman

Abstract

OBIECTIV Fibroza este un semn distinctiv nou al alterării patologice a țesutului adipos alb uman (WAT). Am investigat compoziția fibrozei subcutanate (scWAT) și omentale WAT (oWAT) la obezitate și relația acesteia cu alterările metabolice și pierderea în greutate indusă de chirurgie.

PROIECTAREA ȘI METODELE CERCETĂRII Biopsiile chirurgicale pentru scWAT și oWAT au fost obținute la 65 de obezi (IMC 48,2 ± 0,8 kg/m 2) și 9 subiecți slabi (IMC 22,8 ± 0,7 kg/m 2). Subiecții obezi care erau candidați la chirurgia bariatrică au fost caracterizați clinic înainte, la 3, 6 și 12 luni după operație, inclusiv evaluarea masei grase prin absorptiometrie cu raze X cu energie duală. Fibroza WAT ​​a fost cuantificată și caracterizată utilizând PCR cantitativă, observație microscopică și imunohistochimie.

Parametrii clinici și biologici.

Picrosirius și colagen VI colorare pe secțiuni de țesut adipos. A: Compararea secțiunilor obW scWAT (panoul stâng) și oWAT (panoul drept) la mărire redusă. B - E: secțiune Omental WAT cu colorare picrosirius (panourile din stânga). Aceeași secțiune observată la lumina polarizată (panourile din dreapta); săgețile arată acumularea de fibroză în jurul adipocitelor (adică, fibroza pericelulară). F: Colorare cu anticorp de colagen VI de oWAT slab (stânga) și obez (dreapta). V, vas; B, pachet. (O reprezentare digitală de înaltă calitate a acestei cifre este disponibilă în numărul online.)

Examinarea microscopică detaliată a diapozitivelor oWAT a arătat că fibrele de colagen sunt organizate în mănunchiuri de diferite grosimi (Fig. 1B și C, panourile din stânga), conținând câteva adipocite izolate de restul parenchimului (Fig. 1C). Fibroza a fost abundentă în jurul vaselor (Fig. 1D, panoul din stânga). Mai mult, fibrile mai subțiri de colagen înconjurate de adipocite localizate în zone apropiate de fascicule fibrotice, demonstrând fibroză pericelulară (Fig. 1E, panoul din stânga). Interesant este că aceste adipocite au avut o dimensiune mai mică (44,4 ± 1,4 μm), comparativ cu celulele fără fibroză localizate în parenchim (64,2 ± 2,0 μm, n = 10, P = 0,002). În secțiunile slabe oWAT, această depunere specifică de colagen în jurul adipocitelor a fost rareori prezentă și s-a găsit doar aproape de pachete fibroase (datele nu sunt prezentate).

Când au fost examinate cu microscopie cu lumină polarizată, aceleași diapozitive au demonstrat că fibrele de colagen de tip I (marcate cu roșu) și de tip III (marcate cu verde) erau prezente în mănunchiuri de fibroză (Fig. 1B - D, panouri drepte) și în jurul adipocitelor. 1E, panoul din dreapta). Deoarece această tehnică nu permite vizualizarea colagenului VI, am efectuat colorarea imunohistochimică cu un anticorp VI anticolagen. Depunerea de colagen VI a fost observată în jurul adipocitelor (Fig. 1F) și în cantități mai mari la obezi (panoul din dreapta) decât la oWAT slab (panoul din stânga). Spre deosebire de alte izotipuri de colagen, colorarea colagenului VI nu a fost găsită în pachetele fibroase.

Pentru a fundamenta observațiile microscopiei optice, am explorat eșantionul WAT obez cu o microscopie electronică de transmisie. Depozitele de colagen au fost detectate între adipocite (vezi Fig. 1 suplimentară). Unele fibrile de colagen prezintă striații periodice caracteristice sugestive ale colagenului de tip I, în timp ce alte fibrile de colagen nu au fost organizate în structuri de fibre, o caracteristică a colagenului de tip VI.

Abundența tipurilor de celule în depozitele fibrotice ale țesutului adipos.

Biopsiile scWAT și oWAT asociate au fost colorate de hematoxilină/eozină pentru a detecta prezența celulelor în fibroză. Deși puțini nuclei au fost observați în pachetele de fibroză în scWAT (Fig. 2A, panoul stâng), au fost detectați abundent în fibroza oWAT (Fig. 2A, panoul drept). Astfel, fibroza prezintă caracteristici distincte în funcție de localizarea WAT, cu mai multă fibroză hipocelulară în scWAT decât în ​​oWAT. Analiza PCR pe probe asociate de adipocite și fracțiuni SVF a relevat că expresia a trei colageni a fost de 4 până la 12 ori mai mare în celulele SVF decât în ​​adipocite (Fig. 2B), indicând faptul că principala sursă celulară de colageni în WAT uman este în celulele fracției vasculare stromale.

Identificarea diferitelor tipuri de celule prezente în fibroza obeză oWAT. Secțiunile seriale ale oWAT uman au fost colorate pentru markeri ai limfocitelor T (CD3), mastocite (triptază), celule fibroblastice (αSMA) și pentru macrofage CD40 + și CD206 +. Săgețile arată celule pozitive în zona fibrozei dezvăluite cu sistemul DAB (colorare maro). Nucleurile au fost colorate cu hematoxilină (colorare albastră). V, vas. (O reprezentare digitală de înaltă calitate a acestei cifre este disponibilă în numărul online.)

Obezitatea este asociată cu fibroza crescută în țesutul adipos.

Fibroza totală și pericelulară în WAT a subiecților slabi și obezi. Comparația fibrozei totale (A) și pericelulare (B) la scWAT (bare deschise) și oWAT (bare negre) a 7 subiecți slabi și 65 obezi (OB). Datele arată cantitatea de suprafață fibrotică ca procent din suprafața totală descrisă în proiectarea și metodele cercetării; * P Vizualizați acest tabel:

  • Vizualizați în linie
  • Vizualizați fereastra pop-up

Analiza de corelație între cantitatea totală de fibroză în scWAT și oWAT și caracteristicile clinice la 65 de pacienți obezi

Am efectuat o analiză multivariată, luând în considerare sexul, starea diabetică și valorile transformate în jurnal ale vârstei, IMC și fibroza omentală totală. Această analiză a confirmat asocierea negativă puternică dintre trigliceridele circulante și fibroza omentală. Această asociere a rămas semnificativă după adăugarea unui diametru adipocit în model, sugerând că acești doi factori sunt legați de nivelurile de trigliceride (Tabelul 2 suplimentar).

Scăderea pierderii de masă a grăsimii în bypassul gastric se asociază cu fibroza țesutului adipos subcutanat.

Cei 65 de pacienți au fost candidați la intervenția de by-pass gastric și au fost urmăriți timp de un an cu puncte de control clinic la 3, 6 și 12 luni după operație (Tabelul 2). Deși bypass-ul gastric este o procedură drastică asociată cu pierderea majoră a grăsimii corporale și cu dimensiunea redusă a adipocitelor, există o variație binecunoscută a cantității de greutate și pierderea de grăsime după un an (17). IMC inițial, vârsta și starea metabolică (de exemplu, diabetul) s-au dovedit a fi factori care modulează cantitatea de pierdere în greutate (25,26). Am făcut ipoteza că cantitatea de fibroză din depozitele de grăsime se asociază cu pierderea masei grase. Figura 5A arată scăderea masei grase exprimată ca procent din valoarea inițială.

Caracteristicile clinice și biologice ale subiecților obezi înainte de operație, la 3 luni, 6 luni și la 1 an după operație

Gruparea profilurilor de pierdere a masei grase la subiecții obezi și relația cu fibroza scWAT. R: Modificările individuale ale masei grase la 3, 6 și 12 luni după operație au fost grupate folosind un algoritm k-mediu recent implementat dedicat datelor longitudinale. Panoul prezintă modificări individuale ale masei grase exprimate ca modificări la valorile 3, 6 sau 12 luni/timp 0. Au fost construite trei clustere. A, B și C sunt media modificărilor masei de grăsime din fiecare grup grupat. B: Media fibrozei totale scWAT sau a fibrozei pericelulare în fiecare grup grupat, A, B și C. Fibroza pericelulară este semnificativ mai abundentă în grupul C comparativ cu A și B. * P = 0,01 ** P = 0,001.

Folosind un test de corelație Spearman, am găsit corelații negative semnificative între cantitatea de fibroză totală în scWAT înainte de intervenție și procentul pierderii de masă grasă la 3 luni (R = -0,39, P = 0,004), 6 luni (R = -0,31, P = 0,030) și la 12 luni (R = -0,30, P = 0,040) după operație. Corelații negative similare s-au găsit între fibroza pericelulară și pierderea masei grase la 3 luni (R = -0,23, P = 0,008), 6 luni (R = -0,32, P = 0,020) și 12 luni (R = -0,30, P = 0,030).

Deoarece răspunsurile individuale au fost foarte variabile, am folosit o abordare de grupare care să permită gruparea subiecților în trei partiții. Tabelul suplimentar 3 rezumă diferențele clinice dintre cele trei grupuri grupate. Subiecții din grupul C au pierdut mai puțină masă de grăsime corporală după operație, comparativ cu grupurile A și B. Subiecții din grupul C au avut IMC mai mare, nicio diferență în adiponectina serică, trigliceride și colesterol și au crescut semnificativ IL-6 plasmatic. Acest lucru ne-a determinat să efectuăm o analiză a modelelor multivariate pentru a explica procentul pierderii de masă grasă la 3, 6 și 12 luni după operație, folosind fibroza IL-6 și scWAT ca variabile explicite. Ajustarea cu IL-6 a modificat doar marginal asocierile semnificative dintre fibroza scWAT și procentul pierderii masei grase la momentele de urmărire (Tabelul suplimentar 4).

Apoi am comparat depozitele fibrotice și datele clinice înainte de intervenția în cele trei grupuri grupate A, B și C. Subiecții din grupul C au demonstrat o tendință de creștere a fibrozei totale și o cantitate semnificativ mai mare de fibroză pericelulară în scWAT (P = 0,008), comparativ cu Grupuri de subiecte A sau B (Fig. 5B).

DISCUŢIE

Am efectuat aici o analiză detaliată a naturii fibrozei în două depozite WAT distincte și am explorat asocierea acesteia cu parametrii clinici ai pacienților obezi. Arătăm, pentru prima dată, prezența diferitelor tipare de depozite fibroase și organizarea detaliată a fibrelor de colagen în WAT uman. Fibroza apare distribuită în mănunchiuri cu grosime variabilă, care pot conține unele adipocite izolate de restul parenchimului. Observația detaliată a structurii fibroase arată, de asemenea, fibroza care se întinde în jurul fiecărui adipocit (adică, fibroză pericelulară), o dispoziție de fibre care poate afecta direct biologia celulelor adipoase. Interesant, am observat că unele adipocite înghițite de fibroză s-au colorat negativ pentru perilipină (Fig. 2 suplimentară), care amintește de adipocitele perilipin-negative descrise anterior în structurile coroanelor de macrofage (27). Acest lucru sugerează că fibroza ar putea fi un răspuns la semnalele care apar din adipocitele disfuncționale sau pe moarte.

Colagenii de tip I și III au fost observați mai frecvent în fascicule fibroase, în timp ce colagenul de tip VI înconjura adipocitele parenchimatoase, în special la subiecții obezi. Astfel, colagenul VI poate reprezenta o proporție mică din colagenul total în WAT uman, în contrast cu WAT de șoarece în care colagenul VI este exprimat abundent (11). La o populație mare de bărbați cu greutate normală și supraponderali, Pasarica și colab. (15) au arătat că expresia genei de colagen de tip VI în scWAT crește cu IMC. În populația noastră de subiecți cu IMC extrem, deși nu putem exclude expresia crescută a colagenului VI în WAT, nu s-a stabilit nicio relație între IMC și cuantificarea totală a colagenului pe baza colorării picrosiriului.

Mecanismele și cinetica acumulărilor de depozite fibrotice sunt necunoscute și dificil de studiat la om. În special, legătura sugerată dintre depozitele fibrotice și acumularea celulelor imune în parenchimul WAT obez (12,28) nu apare direct pe baza datelor noastre. Fibroza a fost mai abundentă în subcutanat decât în ​​depozitele omentale unde acumularea celulelor inflamatorii este mai mare. Nu am găsit corelații între cuantificarea fibrozei și inflamația sistemică de grad scăzut pe baza măsurilor de circulare a proteinelor IL-6 sau C-reactive. Macrofagele atât ale fenotipului M1 cât și ale M2 și ale mastocitelor au fost principalele celule imune găsite în zona fibrotică, unde limfocitele T au fost mai puțin frecvente. Fibroza este de obicei considerată o tulburare fibroproliferativă, cu producția necontrolată de componente ECM de către fibroblaste activate de un microambient inflamator. Deși am găsit celule αSMA-pozitive în benzi fibrotice, imunofluorescența a evidențiat, de asemenea, că aceste celule prezintă caracteristici ale preadipocitelor. Acest lucru este în acord cu experimentele noastre anterioare în care am arătat capacitatea preadipocitelor umane de a secreta factori fibrotici în condiții inflamatorii (8,10).

Studii recente sugerează că adiponectina exercită efecte antifibrotice parțial prin reducerea semnalizării profibrotice TGF-β în modele experimentale de fibroză hepatică sau cardiacă (29,30). Deși nu au fost disponibile măsuri pentru grupul slab din acest studiu, este bine stabilit că nivelurile de adiponectină sunt reduse la obezitate. Această caracteristică ar putea contribui la promovarea depunerii fibrozei în WAT. Cu toate acestea, datele noastre nu au reușit să demonstreze o relație între adiponectină și fibroza WAT ​​în grupul obez, iar adiponectinemia mai mică nu a discriminat subiecții incluși în grupul C caracterizați prin cantități mai mari de fibroză pericelulară în scWAT (Tabelul suplimentar 3). Studii suplimentare care investighează evoluția fibrozei WAT în raport cu creșterea adiponectinei plasmatice indusă de pierderea în greutate ar contribui la fundamentarea implicației adiponectinei în fibroza WAT ​​umană.

Acest studiu oferă o nouă perspectivă asupra compoziției în fibroza WAT, care arată un model diferit și o semnificație fiziopatologică distinctă în WAT subcutanat și omental. Într-adevăr, aceste două tipuri de fibroză arată diferențe în organizarea, cantitatea, natura și influența lor în parametrii clinici ai pacienților obezi. O constatare majoră este scăderea pierderii de masă grasă la pacienții cu niveluri ridicate de fibroză în țesutul adipos subcutanat, care proiectează această modificare ca un factor predictiv potențial pentru rezistența la pierderea în greutate la subiecții obezi.

MULȚUMIRI

Acest program a fost susținut de Comisia Comunităților Europene (proiectul colaborativ ADAPT, numărul contractului HEALTH-F2-2008-201100), consorțiul Hepadip (http://www.hepadip.org/, contract LSHM-CT-2005-018734), de INSERM. Această activitate clinică a fost susținută de Programul Hospitalier de Recherche Clinique, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris (AOR 02076), Contrat de Recherche Clinique (până la C.P.) și de sprijinul Fondation pour la Recherche Medicale (la A.D.).

Nu au fost raportate potențiale conflicte de interese relevante pentru acest articol.

ANUNȚ. efectuarea cuantificării fibrozei, observarea microscopică la lumină polarizată, imunohistologia și colorarea imunofluorescenței, experimentele de expresie genică, au participat la toate analizele de date și la scrierea manuscriselor. J.T. a efectuat cuantificarea fibrozei pericelulare și microscopia electronică, a participat la toate analizele de date și la scrierea manuscriselor. D.L. a ajutat la proiectarea experimentelor și a experimentelor in vitro și a asistat la interpretarea datelor și la scrierea manuscriselor. N.V. recoltate probe de țesut obez. D.H. pregătite diapozitive de țesut adipos pentru imunohistochimie. A.A. recoltate probe de țesut slab. A.B., M.G.-M. și P.B. asistat cu interpretarea datelor și scrierea manuscriselor. C.P. a colectat toți parametrii clinici și a asistat la scrierea manuscriselor. J.-D.Z. a efectuat analize de clusterizare. K.C. a proiectat experimentele, a participat la toate analizele datelor și a pregătit manuscrisul.

Autorii doresc să le mulțumească lui Nathalie Colnot, Departamentul de Patologie al Spitalului Beaujon și Jean-François Bedel, Centrul de Căutare în Nutriție Humaine-Ile de France (Direcția de la Căutare Clinique) pentru colorarea picrosirius roșu și cuantificarea fibrozei, și Patricia Bonjour, Anatomopatologie Departamentul Spitalului Hôtel-Dieu, pentru ajutor și sprijin histologic. Autorii îi mulțumesc Dr. Florence Marchelli și Mme Christine Baudoin, Centrul de căutare în nutriție umană din Franța, Spitalul Pitié-Salpêtrière, care au contribuit la colectarea datelor clinice și biologice la pacienți și la constituirea bazei de date. Patricia Ancel, Departamentul de nutriție, Spitalul Pitié-Salpêtrière, a efectuat evaluarea dimensiunii adipocitelor. De asemenea, autorii îi mulțumesc Dr. Valérie Paradis, Departamentul de Patologie al Spitalului Beaujon, pentru discuții științifice.