Identificarea unei peptide O-glucozilate din EGF2 din NOTCH1 prin LC-MS/MS. Proteina NOTCH1 EGF1-18 a fost produsă în celulele HEK293T de tip sălbatic și purificată din mediul de cultură, așa cum este descris în Materiale și metode. Proteina a fost redusă, alchilată și purificată prin SDS-PAGE și supusă digestiei în gel cu tripsină. Peptidele rezultate au fost analizate prin LC-MS/MS, așa cum este descris în materiale și metode. (A) Panoul superior arată un spectru MS de 23,8 la 24,0 min. Panoul de jos arată spectrul MS/MS al glicopeptidei din EGF2 modificat cu o trizaharidă Xyl-Xyl-Glc. Diamantul roșu denotă ionul parental. Numeroși ioni b și y au confirmat identitatea peptidei 57-CQDSNPCLSTPCK-69 de la NOTCH1. (B) Sunt prezentate cromatogramele ionice extrase (EIC) căutate pentru glicopeptidele modificate cu diferite glicoforme. (C) Cuantificarea a fost efectuată utilizând înălțimea EIC a ionilor detectați și cantitatea totală de peptide detectate (glico) cu diferite glicoforme setate la 100% (n = 3). Bara de erori arată eroarea standard a mediei. Bară neagră - peptidă goală; cerc albastru - glucoză; stea portocalie - xiloză.

Repetările EGF din NOTCH2 sunt modificate cu O -Glc trizaharide. Analiza spectrometrică de masă a glicanilor O-Glc de la șoarece NOTCH2 produs în celulele HEK293T. Probele au fost generate în celule HEK293T de control tip sălbatic, celule DX GXYLT1/2 și celule KO XXYLT1 transfectate cu plasmidele care codifică domeniile extracelulare NOTCH2 de șoarece (ECD), așa cum este descris în Procedurile experimentale. Datele sunt derivate din analiza mouse-ului NOTCH2 EGF1-36. Spectrele MS/MS au confirmat identitatea peptidelor (glico) pe baza prezenței ionilor b și y specifici peptidei și a pierderii neutre a glicanilor preziți. Spectrele MS/MS sunt prezentate în Figura S2. Secvența peptidelor, masa prezisă și măsurată (m/z) și starea de încărcare sunt rezumate în Tabelul S2. Cuantificarea a fost efectuată utilizând înălțimea EIC-urilor și cantitatea totală de peptide detectate (glico) cu diferite glicoforme este stabilită la 100%. Datele sunt derivate din cel puțin două replici biologice. Mai multe detalii sunt prezentate în Tabelul S2. Literele colorate din secvențele tabelului prezintă site-urile de modificare post-traducere prevăzute. Albastru - O -Glc; roșu— O -Fuc; verde - O-GlcNAc; galben— N -glican; violet - β-hidroxilare.

XYLT-urile nu sunt necesare pentru exprimarea suprafeței celulare a NOTCH1 și NOTCH2 endogene în celulele HEK293T. (A) Histogramele expresiei endogene NOTCH1 în tip sălbatic și clonele KO ale XYLTs ale celulelor HEK293T analizate prin citometrie în flux. (B) Intensitatea medie a fluorescenței din (A). Parcele provin din trei experimente independente (n = 3). Bara de erori denotă eroarea standard a mediei (SEM). Graficele cu bare arată media ± SEM. (C) Histograme de expresie endogenă NOTCH2 în tip sălbatic și clone KO ale XYLTs ale celulelor HEK293T analizate prin citometrie în flux. (D) Intensitatea medie a fluorescenței din (C). Parcele provin din trei experimente independente (n = 3). Graficele cu bare arată media ± SEM. Numerele de celule de pe axa verticală a graficelor pentru (A, C) sunt normalizate cu valoarea modului. n.s., nesemnificativ (p> 0,05).

Extensia xilozilică a glicanilor O-Glc îmbunătățește secreția ECD-urilor NOTCH1 și NOTCH2 supraexprimate în celulele HEK293T. (A) Test de secreție cu versiunea etichetată Myc-His6 a EGF1-36 a NOTCH1 (N1 EGF1-36) în controlul de tip sălbatic și clonele KO ale XYLTs. Proteinele N1 EGF1-36 din mediul de cultură și lizatele celulare au fost detectate prin Western blot folosind un anticorp anti-Myc. EV, vector gol; N1, NOTCH1; G1, GXYLT1; G2; GXYLT2, X1; XXYLT1. Este prezentată o imagine reprezentativă a trei experimente independente. (B) Sunt indicate intensitățile relative ale proteinelor N1 EGF1-36. Parcele provin din trei experimente independente (n = 3). Graficele cu bare arată media ± SEM. * p C) Test de secreție cu versiunea etichetată Myc-His6 a EGF1-36 a NOTCH2 (N2 EGF1-36) în controlul de tip sălbatic și clonele KO ale XYLTs. Proteinele N2 EGF1-36 din mediul de cultură și lizatele celulare au fost detectate prin Western blot folosind un anticorp anti-Myc. EV, vector gol; N1, NOTCH1; G1, GXYLT1; G2; GXYLT2, X1; XXYLT1. Este prezentată o imagine reprezentativă a trei experimente independente. (D) Sunt indicate intensitățile relative ale proteinelor N2 EGF1-36. Parcele provin din trei experimente independente (n = 3). Graficele cu bare arată media ± SEM. Datele brute sunt disponibile în Figura S8. *, p p ≥ 0,05).

Rolul potențial al extensiei xilozil a glicanilor O-Glc în controlul calității NOTCH1 și NOTCH2. (A) Alinierea secvenței a tuturor celor 17 repetări EGF ale NOTCH1 (coloana din stânga) și NOTCH2 (coloana din dreapta) pentru om și șoarece, adăpostind secvența consens O-Glc cu repetarea EGF 1 din factorul uman IX (hFA9). Site-ul de modificare O-Glc din secvența consens este evidențiat în negru și indicat cu un cerc albastru. Șase reziduuri de cisteină conservate sunt evidențiate în galben. Se arată că o trizaharidă O-Glc interacționează intramolecular cu regiunea hidrofobă formată din Proline 55 și Tirozină 69 în repetarea EGF hFA9 (17). Pozițiile corespunzătoare sunt evidențiate în verde. (B) Prezentarea schematică a efectelor pierderii XYLT-urilor asupra expresiei suprafeței celulare a NOTCH1 și NOTCH2. Pierderea XYLTs în celulele HEK293T nu a provocat nicio modificare în expresia suprafeței celulare a NOTCH1 și NOTCH2 endogene (sus). Când NOTCH1 și NOTCH2 sunt supraexprimate, pierderea atât a GXYLT1, cât și a GXYLT2 a scăzut semnificativ expresia suprafeței celulare, în timp ce pierderea XXYLT1 a arătat un efect mai ușor, dar substanțial (partea de jos).

Abstract

xilozil

Identificarea unei peptide O-glucozilate din EGF2 din NOTCH1 prin LC-MS/MS. Proteina NOTCH1 EGF1-18 a fost produsă în celulele HEK293T de tip sălbatic și purificată din mediul de cultură, așa cum este descris în Materiale și metode. Proteina a fost redusă, alchilată și purificată prin SDS-PAGE și supusă digestiei în gel cu tripsină. Peptidele rezultate au fost analizate prin LC-MS/MS, așa cum este descris în materiale și metode. (A) Panoul superior arată un spectru MS de 23,8 la 24,0 min. Panoul de jos arată spectrul MS/MS al glicopeptidei din EGF2 modificat cu o trizaharidă Xyl-Xyl-Glc. Diamantul roșu denotă ionul parental. Numeroși ioni b și y au confirmat identitatea peptidei 57-CQDSNPCLSTPCK-69 de la NOTCH1. (B) Sunt prezentate cromatogramele ionice extrase (EIC) căutate pentru glicopeptidele modificate cu diferite glicoforme. (C) Cuantificarea a fost efectuată utilizând înălțimea EIC a ionilor detectați și cantitatea totală de peptide detectate (glico) cu diferite glicoforme setate la 100% (n = 3). Bara de erori arată eroarea standard a mediei. Bară neagră - peptidă goală; cerc albastru - glucoză; stea portocalie - xiloză.

Repetările EGF de la NOTCH2 sunt modificate cu O -Glc trizaharide. Analiza spectrometrică de masă a glicanilor O-Glc de la șoarece NOTCH2 produs în celulele HEK293T. Probele au fost generate în celule HEK293T de control tip sălbatic, celule DX GXYLT1/2 și celule KO XXYLT1 transfectate cu plasmidele care codifică domeniile extracelulare NOTCH2 de șoarece (ECD), așa cum este descris în Procedurile experimentale. Datele sunt derivate din analiza mouse-ului NOTCH2 EGF1-36. Spectrele MS/MS au confirmat identitatea peptidelor (glico) pe baza prezenței ionilor b și y specifici peptidei și a pierderii neutre a glicanilor preziți. Spectrele MS/MS sunt prezentate în Figura S2. Secvența peptidelor, masa prezisă și măsurată (m/z) și starea de încărcare sunt rezumate în Tabelul S2. Cuantificarea a fost efectuată utilizând înălțimea EIC-urilor și cantitatea totală de peptide detectate (glico) cu diferite glicoforme este stabilită la 100%. Datele sunt derivate din cel puțin două replici biologice. Mai multe detalii sunt prezentate în Tabelul S2. Literele colorate din secvențele tabelului prezintă site-urile de modificare post-traducere prevăzute. Albastru - O -Glc; roșu— O -Fuc; verde - O-GlcNAc; galben— N -glican; violet - β-hidroxilare.

XYLT-urile nu sunt necesare pentru exprimarea suprafeței celulare a NOTCH1 și NOTCH2 endogene în celulele HEK293T. (A) Histograme de expresie endogenă NOTCH1 în tip sălbatic și clone KO ale XYLTs ale celulelor HEK293T analizate prin citometrie în flux. (B) Intensitatea medie a fluorescenței din (A). Parcele provin din trei experimente independente (n = 3). Bara de erori denotă eroarea standard a mediei (SEM). Graficele cu bare arată media ± SEM. (C) Histograme de expresie endogenă NOTCH2 în tip sălbatic și clone KO ale XYLTs ale celulelor HEK293T analizate prin citometrie în flux. (D) Intensitatea medie a fluorescenței din (C). Parcele provin din trei experimente independente (n = 3). Graficele cu bare arată media ± SEM. Numerele de celule de pe axa verticală a graficelor pentru (A, C) sunt normalizate cu valoarea modului. n.s., nesemnificativ (p> 0,05).

Extensia xilozilică a glicanilor O-Glc îmbunătățește secreția ECD-urilor NOTCH1 și NOTCH2 supraexprimate în celulele HEK293T. (A) Test de secreție cu versiunea etichetată Myc-His6 a EGF1-36 a NOTCH1 (N1 EGF1-36) în controlul de tip sălbatic și clonele KO ale XYLTs. Proteinele N1 EGF1-36 din mediul de cultură și lizatele celulare au fost detectate prin Western blot folosind un anticorp anti-Myc. EV, vector gol; N1, NOTCH1; G1, GXYLT1; G2; GXYLT2, X1; XXYLT1. Este prezentată o imagine reprezentativă a trei experimente independente. (B) Sunt indicate intensitățile relative ale proteinelor N1 EGF1-36. Parcele provin din trei experimente independente (n = 3). Graficele cu bare arată media ± SEM. * p C) Test de secreție cu versiunea etichetată Myc-His6 a EGF1-36 a NOTCH2 (N2 EGF1-36) în controlul de tip sălbatic și clonele KO ale XYLTs. Proteinele N2 EGF1-36 din mediul de cultură și lizatele celulare au fost detectate prin Western blot folosind un anticorp anti-Myc. EV, vector gol; N1, NOTCH1; G1, GXYLT1; G2; GXYLT2, X1; XXYLT1. Este prezentată o imagine reprezentativă a trei experimente independente. (D) Sunt indicate intensitățile relative ale proteinelor N2 EGF1-36. Parcele provin din trei experimente independente (n = 3). Graficele cu bare arată media ± SEM. Datele brute sunt disponibile în Figura S8. *, p p ≥ 0,05).

Rolul potențial al extensiei xilozil a glicanilor O-Glc în controlul calității NOTCH1 și NOTCH2. (A) Alinierea secvenței a tuturor celor 17 repetări EGF ale NOTCH1 (coloana din stânga) și NOTCH2 (coloana din dreapta) pentru om și șoarece, adăpostind secvența consens O-Glc cu repetarea EGF 1 din factorul uman IX (hFA9). Site-ul de modificare O-Glc din secvența consens este evidențiat în negru și indicat cu un cerc albastru. Șase reziduuri de cisteină conservate sunt evidențiate în galben. Se arată că o trizaharidă O-Glc interacționează intramolecular cu regiunea hidrofobă formată din Proline 55 și Tirozină 69 în repetarea EGF hFA9 (17). Pozițiile corespunzătoare sunt evidențiate în verde. (B) Prezentarea schematică a efectelor pierderii XYLT-urilor asupra expresiei suprafeței celulare a NOTCH1 și NOTCH2. Pierderea XYLTs în celulele HEK293T nu a provocat nicio modificare în expresia suprafeței celulare a NOTCH1 și NOTCH2 endogene (sus). Când NOTCH1 și NOTCH2 sunt supraexprimate, pierderea atât a GXYLT1, cât și a GXYLT2 a scăzut semnificativ expresia suprafeței celulare, în timp ce pierderea XXYLT1 a arătat un efect mai ușor, dar substanțial (partea de jos).