Corespondență către: Huan-Long Qin, MD, dr., Departamentul de Chirurgie, al șaselea spital de oameni afiliat la Universitatea Shanghai Jiao Tong, 600 Yishan Road, Shanghai 200233, China. moc.oohay@niqgnolnauh

Telefon: + 86-21-64361349 Fax: + 86-21-64361349

Abstract

OBIECTIV: Investigarea efectului unei diete bogate în grăsimi în formarea precursorilor cancerului colorectal utilizând un model animal.

METODE: Șobolanii Wistar au fost împărțiți în două grupuri care au fost hrănite fie cu o dietă bogată în grăsimi (HFD), fie cu o dietă normală cu grăsimi (ND), iar 1,2-dimetilhidrazină a fost administrată în doză de 40 mg/kg timp de 10 săptămâni . Greutatea corporală/greutatea ficatului/greutatea grăsimii epididimale au fost înregistrate după sacrificarea șobolanilor și s-a observat și formarea adenomului de colon. Nivelurile de insulină, leptină, factor de necroză tumorală (TNF) -α, factor de creștere asemănător insulinei (IGF) -1 și trigliceride au fost determinate prin testul imunosorbent legat de enzime, pentru a compara nivelurile modificate ale indicilor biochimici și citokinele inflamatorii din serul dintre șobolani hrăniți cu ND și HFD. Activitatea de proliferare celulară (Ki-67) a fost determinată prin analize imunohistochimice. Western blot și colorarea cu imunofluorescență au fost folosite pentru a examina expresia antigenului nuclear celular proliferant (PCNA), ciclooxigenazei (COX) -2, ciclinei D1, β-cateninei și proteinelor factorului nuclear (NF) -κB din adenom și țesuturi de control comparative.

REZULTATE: Numărul adenoamelor colonice și al epitelialului Ki-67 a fost semnificativ mai mare în grupul HFD decât în ​​grupul ND. Grupul HFD a avut, de asemenea, greutate corporală crescută, greutate hepatică și greutate epididimală, care au fost asociate cu niveluri crescute de insulină serică, leptină, TNF-α, IGF-1 și trigliceride. HFD a indus reglarea în sus a proteinelor PCNA, COX-2, ciclină D1, β-catenină și NF-κB, așa cum a fost dezvăluit prin Western blot și colorarea imunofluorescentă.

CONCLUZIE: HFD promovează formarea adenomului de colon prin inflamație, anomalii metabolice și crește progresia ciclului celular.

Tipul de bază: Acest studiu a fost întreprins pentru a investiga efectul unei diete bogate în grăsimi asupra incidenței adenomului de colon indus de injecția intraperitoneală de 1,2-dimetilhidrazină la șobolanii Wistar. Am demonstrat că o dietă bogată în grăsimi (HFD) a crescut activitatea proliferativă a celulelor epiteliale colonice și am concluzionat că creșterea tumorii mediată de HFD ar putea fi asociată cu inflamația și creșterea progresiei ciclului celular. Acest studiu ar putea conduce la înțelegerea naturii relației dintre aportul ridicat de grăsimi și riscul crescut de carcinom colorectal.

INTRODUCERE

Cancerul colorectal (CRC), reprezentând aproximativ 10% din cazurile incidente de cancer, este o cauză majoră de morbiditate și mortalitate la nivel mondial, cu> 1 milion de cazuri noi și> 600000 de decese anual, ceea ce îl face a patra cauză principală a deceselor provocate de cancer la nivel global [1,2]. Predispoziția genetică pare să explice doar o mică parte din cazuri, în timp ce mulți dintre factorii de risc pentru CRC sunt asociați cu un stil de viață occidental. Recent, multe studii epidemiologice au furnizat dovezi ale unei relații între aportul de grăsimi din dietă și un risc crescut de CRC [3]. Majoritatea studiilor efectuate pe animale au arătat că o dietă bogată în grăsimi (HFD) duce la un număr crescut de focare de criptă aberante induse chimic (ACF) [4], care sunt leziuni identificabile în carcinogeneza experimentală a colonului și tumorile [5]. În plus, se știe că aportul ridicat de grăsimi alimentare cauzează obezitate la om și la rozătoare [6,7] și a fost implicat și în cancerul de colon [8].

Deși legătura dintre un HFD sau obezitatea indusă de dietă și un risc crescut de CRC a fost investigată în studii observaționale bazate pe populație, precum și în studii in vitro (experimentale) (concentrate mai ales pe incidența FAC sau schimbarea creșterii celule canceroase de colon uman xenogrefate), există puțină înțelegere cu privire la efectul unui HFD în formarea precursorilor (adenoamele colonice) ale CRC. Prin urmare, prezentul studiu a fost întreprins pentru a investiga efectul HFD asupra incidenței carcinogenezei in situ a colonului indusă de 1,2-dimetilhidrazină (DMH).

MATERIALE ȘI METODE

Animale și produse chimice

În acest studiu, s-au utilizat șobolani Wistar masculi de 4 săptămâni (180-200 g) care au fost obținuți de la Shanghai Shriek Laboratory Animal Corporation. Toate animalele au fost adăpostite în cuști de plastic (patru sau cinci șobolani/cușcă) în condiții controlate de umiditate (44 ± 5%), lumină (ciclu 12 ore lumină/întuneric) și temperatură (22 ± 2 ° C). DMH a fost cumpărat de la Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Statele Unite) și proaspăt preparat înainte de utilizare în soluție salină EDTA de 1 mmol/L, cu pH ajustat la 7,0 folosind o soluție diluată de NaOH.

Proceduri experimentale

unei

Protocol de experiment și imagini reprezentative ale adenoamelor colonice. A: Protocolul experimentului adenomului colonic. Șobolanii (în vârstă de 4 săptămâni) au fost împărțiți într-un grup cu dietă normală cu grăsimi (ND) (n = 10) și un grup cu dietă bogată în grăsimi (HFD) (n = 10). La șaisprezece săptămâni după începerea injecției intraperitoneale cu 1,2-dimetilhidrazină (DMH), șobolanii au fost eutanasiați; B: Imagini reprezentative ale adenoamelor la exemplarele de colon din grupul ND (de mai sus) și grupul HFD (de mai jos) atunci când colonele au fost deschise longitudinal. Localizarea adenoamelor este indicată de săgeți.

Necropsie și enumerare tumorală

Cu o zi înainte, animalele au fost eutanasiate, au fost ținute peste noapte în post cu apă potabilă ad libitum și eutanasiate în ziua următoare. După ce au fost anesteziate (ketamină 100 mg/kg + xilazină 15 mg/kg, i.p.), probele de sânge au fost prelevate prin puncție cardiacă [23]. Probele au fost centrifugate timp de 15 minute la 4000 rpm, serul a fost separat și alicotat și congelat la -80 ° C până la o analiză ulterioară. Întregul colon a fost îndepărtat, deschis longitudinal și clătit în soluție salină rece ca gheața. Coloanele au fost așezate pe un prosop aseptic și s-a enumerat numărul total de tumori din întregul colon. După aceea, tumorile au fost tăiate în jumătăți; una a fost pregătită pentru examinare histologică, iar cealaltă a fost plasată într-un criotub și înghețată imediat în azot lichid pentru Western blot. Ficatul și grăsimea epididimală au fost, de asemenea, colectate și cântărite.

Roșu de ulei O colorare

Secțiunile de țesut hepatic din grupurile ND și HFD au fost fixate timp de 24 de ore în paraformaldehidă 4%, acid picric 0,2% și glutaraldehidă 0,5% în tampon fosfat 0,2 mol/L (pH = 7,4) la 4 ° C. După ce au fost spălate timp de 1 zi cu zaharoză 15% la 4 ° C, secțiunile au fost incubate timp de 1 oră într-o baie de vopsea roșie cu ulei pentru a se colora pentru acumularea de grăsime. După ce pata a fost îndepărtată și secțiunile au fost spălate cu izopropanol 60%, imaginea fiecărui grup a fost fotografiată.

Test legat de imuno absorbția enzimelor

Nivelurile trigliceridelor serice, colesterolului, insulinei, IGF-1, leptinei și TNF-α, IL-6, CXCL-10 au fost măsurate folosind kituri corespunzătoare de testare imunosorbentă legată de enzime (ELISA) (RD, Minneapolis, MN, Statele Unite) (n = 10 din fiecare grup) conform instrucțiunilor producătorului.

Examinări histologice și imunohistochimie

Țesuturile colonului au fost fixate în 10% formalină neutră tamponată cu fosfat, procesate în mod obișnuit, secționate la 5 μm și colorate cu hematoxilină și eozină pentru examinare microscopică ușoară. Pentru imunohistochimie, secțiunile colonice încorporate în parafină fixate cu formalină au fost deparafinizate, rehidratate și incubate timp de 5 minute în H2O2 3% pentru a dezactiva peroxidaza endogenă. Secțiunile au fost blocate cu 5% albumină serică bovină, incubate succesiv cu anticorp anti-Ki-67 (1: 200; Abcam, Cambridge, MA, Statele Unite) și anticorp secundar anti-șoarece de cal biotinilat (Vector Laboratories, Burlingame, CA, Statele Unite) în conformitate cu instrucțiunile producătorului și, în cele din urmă, contracolorate cu hematoxilină. Colorarea Ki-67 a fost evaluată de doi investigatori independenți utilizând microscopie cu lumină în câmp luminos.

Colorarea imunofluorescentă

Pentru a vizualiza expresia ciclooxigenazei (COX) -2 și a proteinelor legate de ciclul celular, cum ar fi antigenul nuclear celular proliferant (PCNA), s-a efectuat imunofluorescența. Secțiunile de parafină au fost blocate pentru peroxidul endogen și tratate pentru recuperarea optimă a antigenului, așa cum s-a descris anterior. Secțiunile au fost incubate cu anticorpi PCNA și COX-2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, Statele Unite). Secțiunile au fost testate în continuare cu un anticorp secundar anti-IgG conjugat cu cianină-3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Philadelphia, PA, Statele Unite). Nucleii celulari au fost colorați cu 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Incubația fără primul anticorp a servit ca un control negativ. Imaginile secțiunilor tumorale au fost achiziționate la microscopul DSY5000X folosind camera Nikon D200 și sistemul de imagine.

Western blot

Țesuturile colonice au fost omogenizate, sonicate și transferate într-un tampon de liză rece cu gheață care conține un inhibitor de protează. Concentrația de proteine ​​a fost determinată folosind kitul de testare a proteinelor BCA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, Statele Unite). Proteinele extrase au fost separate pe 10% SDS-PAGE și transferate pe membrane de difluorură de poliviniliden (Millipore, Bedford, MA, Statele Unite). Membranele au fost apoi incubate la 4 ° C peste noapte cu anticorpii primari corespunzători specifici pentru PCNA, ciclină D1, β-catenină și NF-kB (1: 1000; Tehnologie de semnalizare celulară). După aceea, membranele au fost spălate de trei ori (20 min fiecare) cu soluție salină tamponată cu Tris (TBS) conținând 0,1% Tween 20 (TBS-T) și apoi incubate timp de 1 oră cu anticorpul secundar conjugat cu hrean-peroxidază ( 1: 2000) în TBS-T timp de 4 ore la 4 ° C. În cele din urmă, proteinele au fost vizualizate prin metoda îmbunătățită de chemiluminescență (kit ECL, Pierce) conform instrucțiunilor producătorului. β-actina a fost utilizată ca control intern de încărcare.

analize statistice

Variabilele cantitative au fost analizate utilizând testul t Student sau testul Mann-Whitney. Datele sunt prezentate ca medie ± SD. Intervalele de încredere pe tot parcursul studiului au fost stabilite la 95%. O valoare P față-verso Figura2, 2, greutatea corporală a fost semnificativ mai mare în grupul HFD decât în ​​grupul ND după 1 săptămână de tratament (adică la 6 săptămâni), iar această diferență a fost menținută până la sfârșitul anului studiul (Figura (Figura2A). 2A). La începutul studiului, greutatea corporală medie a fost de 181,5 ± 9,3 g și 187,7 ± 6,5 g în grupurile ND și respectiv HFD (P = 0,054). Până la sfârșitul studiului, la 16 săptămâni, greutatea corporală medie a crescut semnificativ la 317,4 ± 8,2 g în grupul ND și 368,6 ± 13,1 g în grupul HFD (P (Figura 2B, 2B, C). Greutatea grăsimilor epididimale a crescut semnificativ la 3,19 ± 0,26 g în grupul ND și 5,13 ± 0,45 g în grupul HFD (creștere de 1,61 ori, P (Figura 2D 2D).

Modificări ale greutății corporale și imagini reprezentative ale ficatului. A: Modificări ale greutății corporale la șobolanii hrăniți cu o dietă normală cu grăsimi (ND) (linia albastră, n = 10) și o dietă bogată în grăsimi (HFD) (linia roșie, n = 10). S-au observat diferențe semnificative între grupurile ND și HFD în toate momentele, cu excepția celor 2 săptămâni inițiale; B: Imagini reprezentative ale ficatului din grupul ND (stânga) și grupul HFD (dreapta). Ficatul din grupul HFD părea să aibă un aspect asemănător ficatului gras, iar colorarea Oil Red O prezintă, de asemenea, că există mai multe picături de lipide în citoplasma celulelor hepatice. Imagistica a fost documentată la mărirea × 200; C: Greutatea medie a ficatului din cele două grupuri. Fiecare coloană reprezintă media ± SD de 10 șobolani/grup; D: Greutatea medie a grăsimii epididimale din cele două grupuri. Fiecare coloană reprezintă media ± SD de 10 șobolani/grup. și P (Figura 2E). 2E). Numărul mediu de adenoame în grupul HFD a fost de 4,2 pe șobolan, în timp ce grupul ND a avut doar 1,9 tumori pe șobolan (P Figura3A 3A și respectiv B și trebuie remarcat faptul că nu au fost observate diferențe morfologice în adenoame între ND Pentru a examina efectul facilitator al unui HFD asupra formării adenomului colonic, precursorul carcinogenezei colorectale, activitatea proliferativă a celulelor epiteliale colonice a fost determinată folosind colorarea Ki-67. Așa cum se arată în figura 3C-F, 3C - F, care include țesuturile adiacente epiteliale și adenom normale, a existat o creștere semnificativă a colorării Ki-67 în adenoamele din grupul HFD comparativ cu grupul ND. În special, am constatat că în criptele Ki-67 + din epiteliul normal adiacent, Celulele Ki-67 + erau în principal limitate la fundul criptei colonice la șobolanii hrăniți cu ND, în timp ce celulele Ki-67 + din criptele pozitive ale șobolanilor hrăniți cu HFD erau prezenți în cea mai mare parte pe toată înălțimea criptei. aceste rezultate au indicat faptul că activitatea proliferativă a celulelor epiteliale colonice a fost promovată de HFD, ceea ce a dus la o creștere a formării adenomului de colon.