Zachary L. VanAernum

un Departament de Chimie și Biochimie, Universitatea de Stat din Ohio, Columbus Ohio 43210, SUA.

Joshua D. Gilbert

un Departament de Chimie și Biochimie, Universitatea de Stat din Ohio, Columbus Ohio 43210, SUA.

Mihail E. Belov

b Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germania

Alexander A. Makarov

b Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germania

Stevan R. Horning

b Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germania

Vicki H. Wysocki

un Departament de Chimie și Biochimie, Universitatea de Stat din Ohio, Columbus Ohio 43210, SUA.

J.D.G: Thermo Fisher Scientific Inc., 5350 NE Dawson Creek Dr., Hillsboro, Oregon 97124.

Date asociate

Abstract

Abstract grafic

complexelor

Introducere

Disocierea indusă de suprafață (SID) a apărut ca o metodă puternică de activare bazată pe coliziune pentru sondarea structurilor complexe proteice în faza gazoasă, producând fragmentarea care oferă informații complementare care au obținut din metodele de activare menționate anterior. 27 În loc să supună ionii la mai multe coliziuni cu energie redusă cu gazul de fundal, SID experimentează ionii direct într-o suprafață inertă și rigidă pentru a transmite energie analitului într-o singură etapă cu energie ridicată. SID are ca rezultat, în general, o partiționare mai simetrică a sarcinii în subcomplexele produse în raport cu CID 28 și UVPD. 26 După cum sa observat folosind instrumente de mobilitate ionică (IM) -MS, subcomplexele generate prin SID sunt, în general, compacte după disociere, cu secțiuni transversale de coliziune care reflectă structurile (sub) biomoleculare. În plus, SID al complexelor proteice legate de ligand duce adesea la subcomplexe cu liganzi reținuți în buzunarul de legare, ceea ce nu este adesea cazul CID. 30,31 Aceste caracteristici fac din SID un instrument util pentru sondarea complexelor biomoleculare fără structuri rezolvate. 32–34

Până de curând, lucrările care implică SID ale complexelor proteice au fost în mare parte efectuate pe platformele TOF. 35.36 Odată cu utilizarea tot mai mare a MS native pentru caracterizarea structurală a complexelor proteice, a devenit evident că o rezoluție mai mare a masei este deseori de dorit și permite o perspectivă mai profundă asupra unui sistem biologic dat. De exemplu, măsurarea deplasărilor de masă rezultate din modificări post-translaționale și/sau legarea liganzilor mici sau a cofactorilor devine posibilă la nivelul complexului proteic la o rezoluție suficientă. 37.38 Fiecare tip de analizor de masă (TOF, FT-ICR, Orbitrap) are avantaje și dezavantaje, iar alegerea instrumentului va depinde adesea de întrebarea abordată. Grupul nostru a demonstrat recent SID pe o platformă FT-ICR, obținând o rezoluție de masă fără egal a subcomplexelor generate de SID. 39 Cu toate acestea, credem că metodele de activare, cum ar fi SID, ar trebui să fie neutre pentru furnizor și platformă și că SID pe platformele Orbitrap optimizate pentru o gamă crescută de m/z vor fi, de asemenea, benefice pentru utilizatorii de spectrometrie de masă.

Sectiunea Experimentala

Proiectare dispozitiv SID

(A) Desen tehnic al dispozitivului SID cu suporturi de montare. (b) O descriere simplificată în secțiune transversală a dispozitivului SID care prezintă o traiectorie ionică de la dreapta la stânga în modul SID. (c) O diagramă a platformei EMR modificate cu dispozitivul SID prototip instalat între quadrupol și C-trap.

Fabricarea dispozitivului a fost realizată intern de către departamentul de mașini al Departamentului de Chimie și Biochimie al OSU, folosind aluminiu pentru toți electrozii și polimerul polieter eter cetonă (PEEK) pentru a monta și a spaționa corect electrozii. Calea ionică originală rămâne neobstrucționată pentru a permite un impact minim asupra experimentelor numai MS (adică fără activare), precum și experimentelor CID (HCD). Când se dorește SID, electrozii frontali ai dispozitivului SID sunt reglați pentru a direcționa ionii către suprafața din partea superioară a dispozitivului. O descriere detaliată a suprafeței utilizate pentru coliziuni poate fi găsită în altă parte. 35 Pe scurt, o suprafață de sticlă a fost acoperită cu un strat de titan de 10 Å, un strat de aur de 1000 Å și apoi modificată cu un monostrat auto-asamblat cu fluorocarbon. Desenele detaliate și tensiunile aplicate dispozitivului SID pot fi găsite în Figura S1.

Spectrometrie de masa

Materiale

Rezultate si discutii

Streptavidin

Streptavidina servește ca sistem model pentru experimentele SID. Este un homotetramer simetric D2 de 53 kDa, format din subunități dispuse ca un dimer de dimeri (Figura 2a). La activarea prin CID, streptavidina tetramer se disociază în monomeri foarte încărcați și trimeri cu încărcare relativ scăzută (Figura S3). 44 Acest comportament în care o subunitate se desfășoară și ia cu sine o cantitate disproporționat de mare de sarcină este tipic pentru CID datorită procesului său de depunere a energiei cu mai multe etape. 16–18 Important, acest rezultat de disociere de la CID nu acceptă dimerul cunoscut al aranjamentului subunității dimerilor. În schimb, lucrările anterioare au arătat că SID de streptavidin tetramer are ca rezultat producerea de dimeri la energie scăzută și monomeri la energie ridicată, în concordanță cu zonele de interfață și geometria complexă determinată de structura cristalină. 30

(A) Zonele de interfață ale tetramerului streptavidin determinat prin analiza PISA (1SWB). 58 (b) Spectrul de masă al tetramerului streptavidin în condiții de reducere a sarcinii. (c) Spectrul SID (45 V, 495 eV) al tetramerului 11+. (d) Un segment mărit de (c) la 140.000 rezoluție setare, dezvăluind distribuțiile izotopului de 3+ monomer și 6+ homodimer. (e) Un segment mărit de (c) la o setare de rezoluție de 17.500, care arată metionină (s) N-terminale neclivite și aditivi de sodiu pe 3+ monomer și 6+ dimer.

Efectele temperaturii sursei de ioni

Un mare accent în SM nativă constă în păstrarea structurii fiziologice/caracteristicilor structurale ale proteinelor și complexelor de proteine ​​în timpul analizei prin utilizarea unor condiții blânde de instrument pentru ionizare, transfer de ioni și detectare. Din păcate, ca urmare a unor astfel de condiții blânde de instrument, ionii nativi au o tendință crescută de a transporta aducti din săruri și tampoane nevolatile. Aductivitatea excesivă reduce adesea „rezoluția aparentă” a instrumentului mult sub ceea ce este posibil în condiții de denaturare. 48 Regiunea sursă de pe linia de instrumente Exactive este adesea menținută la o temperatură relativ ridicată (200-250 ° C) pentru a îmbunătăți sensibilitatea și decuplarea ionilor pe măsură ce intră în spectrometrul de masă. Deși acest lucru îmbunătățește drastic rezoluția aparentă și sensibilitatea instrumentului, este adesea îngrijorat faptul că temperaturile surse ridicate pot duce la restructurarea ionilor, 49 similar cu ceea ce s-a observat la energiile de disociere induse de coliziune scăzute. 50 Aici folosim SID într-o încercare de a determina dacă temperaturile ridicate ale sursei de ioni afectează structura ionilor de complex proteic.

În studiile anterioare, SID s-a dovedit a face diferența între ioni nativi și ioni care au suferit modificări structurale brute (adică colaps, expansiune) prin pre-activarea ionilor precursori, înainte de disociere. 51 Diferențe notabile în fragmentarea SID au fost observate atunci când ionii precursori au fost activați înainte de SID în comparație cu fragmentarea fără pre-activare. Aceeași sensibilitate la pre-activare este observată cu noul dispozitiv SID din cadrul platformei Q-Exactive EMR, așa cum era de așteptat - SID măsoară sistemul așa cum este prezentat, oferind modele de disociere care variază în funcție de gradul de pre-activare.

Graficele care compară gradul relativ de retenție a biotinei pe (A) tetrameri de streptavidină în funcție de temperatura sursei de ioni, (b) dimerii produși de SID (30 V, 330 eV) ai tetramerilor de streptavidină arătați în partea (a) în funcție de temperatura sursei de ioni și (c) dimeri produși din SID al tetramerului streptavidină-biotină în funcție de tensiunea de accelerație SID la o temperatură constantă a sursei de ioni de 120 ° C. În toate cazurile, barele de eroare sunt reprezentative pentru abaterea standard a măsurătorilor triplicate.

L-glutamat dehidrogenază

Glutamatul dehidrogenază bovină (GDH) este o enzimă homohexamerică de 333,6 kDa aranjată ca un dimer stivuit de trimere cu o antenă înfășurată care iese din și stabilizează fiecare trimer. 55.56 Studiile anterioare au arătat că GDH este dificil de disociat în faza gazoasă de CID, necesitând adesea energii CID ridicate și stări de sarcină precursor ridicate, rezultând în ejectarea unui monomer desfășurat care nu este reprezentativ pentru aranjamentul inițial al subunității. 42.57 În schimb, s-a arătat anterior că SID al hexamerului GDH pe o platformă Q-IM-TOF a dus în primul rând la disocierea hexamerului GDH în trimeri cu disocierea secundară în monomeri. 42 În plus, Ma și colab. a arătat că în condiții de reducere a încărcăturii (adăugarea de TEAA), trimerii și monomerii produși din SID de hexamer GDH rămân compacte și au secțiuni transversale de coliziune similare cu cele așteptate pentru subcomplexele GDH de tip nativ decupate din structura cristalină a hexamerului. Aceste rezultate arată că, spre deosebire de CID, SID poate fi utilizat pentru a elucida topologia hexamerului GDH.

Spectru SID de +28 GDH hexamer la (A) 175 V și (b) Tensiune de accelerație SID de 235 V, rezultând trimere și monomeri care indică aranjamentul dimerului general al trimerelor hexamerului GDH.

Concluzii

Material suplimentar

Mulțumiri

Finanțarea: Autorii recunosc cu recunoștință sprijinul financiar al Fundației Naționale pentru Științe (NSF 1455654 la V.H.W.) și de la Institutele Naționale de Sănătate (NIH P41GM128577 la V.H.W.).

Autorii îi mulțumesc dlui. Larry Antal (Departamentul de chimie și biochimie al OSU), dl. Eric Jackson (Departamentul OSU pentru Departamentul de Chimie și Biochimie) pentru asistență la fabricarea dispozitivelor SID și proiectarea circuitelor de comutare; Maria Reinhardt-Szyba, Dmitry Boll, Alexander Kholomeev, Jan-Peter Hauschild, Eugen Damoc (Thermo Fisher Scientific) pentru asistență și discuții utile cu privire la modificările instrumentelor; Randy Pedder (Ardara Technologies) pentru discuții și asistență electronică de ajutor; Royston Quintyn și Lindsay Morrison pentru experimentele inițiale SID pe platforma Orbitrap folosind un design diferit; Marshall Bern (Protein Metrics Inc.) pentru asistență cu deconvoluția spectrală și cuantificarea relativă; și Jacob McCabe (Universitatea Texas A&M) și Benjamin Jones (Universitatea de Stat din Ohio) pentru asistență la procesarea în serie a calculelor statului mediu de încărcare.

Note de subsol

Informatii justificative: Desene și tensiuni ale dispozitivelor SID detaliate. Diagrama circuitului de comutare pentru alimentarea externă. Spectre numai pentru MS și CID ale streptavidinei și GDH. Spectre de streptavidină dobândite într-o serie de energii SID. Spectre de biotină legate de streptavidin tetramer înainte de SID și dimeri după SID. Comparația legării biotinei la dimerul streptavidinei în funcție de temperatura sursei de ioni și de energia SID. CID al tetramerului streptavidină-biotină. Valorile medii ale stării de încărcare pentru dimerii streptavidin-biotină.