1 Laborator de bacteriologie, Grupul de sănătate animală, EEA INTA, 7620 Balcarce, Argentina

2 Facultad Ciencias Agrarias, UNMdP, CC 276, 7620 Balcarce, Argentina

3 Facultatea de Științe Veterinare, UNCPBA, Campus Universitario, Paraje Arroyo Seco, 7000 Tandil, Argentina

Abstract

1. Introducere

Mycobacterium avium subsp. paratuberculoză (MAP) este agentul cauzal al paratuberculozei sau al bolii Johne. MAP afectează animalele domestice și sălbatice și, la vaci, provoacă enterite cronice, diaree, scădere în greutate și emaciație progresivă care poate duce în cele din urmă la moarte [1]. MAP a fost, de asemenea, legată de boala Crohn umană, o tulburare sistemică care provoacă în principal o inflamație cronică a intestinului [2]. Se sugerează că oamenii ar putea fi infectați prin lapte contaminat, deși se știe relativ puțin despre supraviețuirea MAP în timpul manipulării laptelui industrial. Unii autori au sugerat că pasteurizarea este capabilă să distrugă micobacteriile. Astfel, s-au efectuat teste de laborator pentru a evalua rezistența la căldură MAP în funcție de distribuția diferențiată a tratamentului termic în timpul pasteurizării [3-6]. În contrast, alți autori susțin teoria conform căreia MAP este capabil să reziste pasteurizării atunci când este prezentă în laptele crud [7-13].

MAP viabil a fost detectat în laptele pasteurizat comercial din Marea Britanie, SUA, Republica Cehă și India [10, 11, 14-16]. Mai mult, în Republica Cehă, folosind F-57 sau IS900 PCR în timp real, MAP a fost detectată la 49% din probele de lapte praf pentru sugari, un studiu a dat MAP viabil [17].

Cu toate acestea, s-a publicat puțin despre MAP în produsele lactate, altele decât lichidul de lapte praf și o parte din brânză. În general, produsele lactate fermentate oferă bariere semnificative în calea creșterii agentului patogen, începând cu tratamentul termic în timpul pasteurizării, urmat de adăugarea unei culturi inițiale și a mediului de aciditate în timpul fermentării, precum și depozitare frigorifică. van Brandt și colab. a inoculat MAP în lapte cu temperatură foarte înaltă (UHT) și a observat că numărul inițial de MAP, în timpul fermentării iaurtului urmat de depozitare la 6 ° C, a rămas neschimbat timp de peste 6 săptămâni, indiferent de cultura de start care a fost utilizată sau de conținutul de grăsime din lapte [18 ].

Scopul acestui studiu a fost de a afla viabilitatea MAP, E coli, și S. Enteritidis în timpul procesării tradiționale și păstrării la frigider a iaurtului obținut din lapte după inoculare experimentală și determinați dacă există efecte sinergice sau antagoniste între aceste bacterii.

2. Materiale și metode

2.1. Tulpini de bacterii

Tulpinile bacteriene au fost izolate la laboratorul de bacteriologie al Institutului Național de Tehnologie Agricolă (INTA), Balcarce (Argentina), folosind tulpina MAP INTA SB, izolată dintr-un lapte comercial, E coli tulpina INTA 116/C3, obținută din fecale bovine și S. Tulpina Enteritidis INTA 86/360, izolată de păsări de curte.

2.2. Pregătirea inoculelor

Pentru prepararea inoculului, tulpinile menționate anterior au fost decongelate din azot lichid. MAP a fost cultivat pe mediu solid de gălbenuș de ou Herrold (HEYM) plus 0,0002% (greutate/vol) micobactină J (Allied Monitor Inc., Fayette, MO, SUA) și piruvat de sodiu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, SUA ) timp de 8 săptămâni la 37 ° C. Pentru pregătirea inoculului, puține colonii au fost suspendate în 15 ml de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) (pH = 7), ajustată la turbiditatea de 0,5 la scara McFarland [25] conținând

unități care formează colonii

. E coli a fost cultivat pe agar McConkey (MC) și S. Enteritidis a fost cultivat pe agar Xilosa-Lisina-Desoxicolato cu adăugarea de 0,46% de Tergitol-4 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, SUA) (XLDT4). Ambele agare MC și XLDT4 au fost incubate peste noapte la 37 ° C. După aceea, o colonie din oricare E coli sau S. Enteritidis a fost suspendat în PBS pH 7,2 și utilizat pentru a însămânța bulionul de infuzie creier-inimă (BHI) (Oxoid, Marea Britanie), care au fost incubate în continuare peste noapte la 37 ° C. Pentru prepararea inoculului ambele tuburi BHI au fost diluate cu PBS (pH = 7,2) până la o concentrație finală de unități care formează colonii .

2.3. Pregătirea iaurtului

Au fost preparate trei iaurturi tradiționale folosind 360 ml de lapte UHT comercial, 125 g de iaurt comercial care conține o cultură inițială de Streptococcus thermophilus și Lactobacillus bulgaricus, și 5 ml de inocul bacterian corespunzător: Iaurt 1 (Y1): HARTĂ, Iaurt 2 (Y2): E coli + S. Enteritidis și Iaurt 3 (Y3): HARTĂ + E coli + S. Enteritidis. Fermentarea a fost efectuată într-un agitator orbital termostatic (New Brunswick Scientific, Model E24) la 43 ° C timp de 3 ore. Ulterior, iaurturile au fost depozitate la 4 ° C timp de 20 de zile.

2.4. Mostre de iaurt

Probele de 50 ml au fost luate înainte și pe tot parcursul timpului de preparare la 20 min, 45 min, 65 min, 90 min, 115 min, 135 min, 155 min, 180 min și 270 min. Mai mult, probele au fost prelevate și în timpul depozitării la 4,5 ore, 24 ore, 48 ore, 4 zile, 10 zile, 15 zile și 20 de zile după inoculare.

2.5. Numărul de bacterii vii

HARTĂ. Pentru decontaminarea probelor, metoda propusă de Tacquet și colab. [26] a fost utilizat cu unele modificări: 35 ml din fiecare iaurt au fost centrifugați la 6000 rpm timp de 20 de minute într-o centrifugă frigorifică (Sigma 16-K, Germania) și peleta a fost resuspendată în 15 ml acid oxalic la 5% (greutate)/vol). Probele au fost menținute la 37 ° C timp de 10 minute și apoi centrifugate încă o dată. Ulterior, peleta a fost resuspendată în 2 ml PBS și în final 160 μL a fost cultivat în HEYM plus vancomicină 0,01% (greutate/vol), amfotericină B 5% (greutate/vol), acid nalidixic 0,3% (greutate/vol) și nistatină 0,01% (greutate/vol). Mediul a fost incubat la 37 ° C timp de 40 de zile și a fost observat săptămânal pentru creșterea MAP. CFU final a fost calculat luând în considerare faptul că fiecare înclinare a fost inoculată cu 160 μL. Rezultatele sunt exprimate ca de iaurt.

E. coli și S. enteritidis. S-au luat 5 ml din fiecare probă de iaurt și s-au făcut 10 diluții logaritmice zecimale în PBS (pH = 7,2). Folosind metoda Miles and Misra [27], o alicotă de 20 μL din fiecare diluție a fost placat pe triplicat MC și XLDT4 pentru E coli și S. Tulpini de enteritidis, respectiv. Plăcile de agar au fost incubate peste noapte la 37 ° C și apoi coloniile au fost numărate în diluția care a permis identificarea a 3-30 de colonii separate. Rezultatele au fost exprimate ca de iaurt.

2.6. Determinarea pH-ului

pH-ul a fost măsurat folosind un pH-metru (Schott Gerate, CG 820, SUA).

2.7. Analize statistice

Curbele de regresie liniară ale numărului de jurnale au fost analizate în funcție de timpul de pregătire și depozitare. Analiza a fost efectuată numai pentru E coli și S. Enteritidis prin compararea comportamentului ambelor bacterii din iaurt și a fiecăruia din cele două bacterii de iaurt care au fost inoculate. A fost utilizat programul de analiză statistică (SAS) [28].

3. Rezultate

3.1. Harta contează

La începutul procesului de pregătire, numărul de MAP în Y1 și Y3 au fost 46 și respectiv 127. În timpul procesului de pregătire (până la 135 de minute) MAP nu a fost detectat în niciunul dintre iaurturi. După aceea, MAP contează în Y1 au fost 5,6 la 180 min, dar MAP nu a fost izolat de Y3. După 4,5 ore și în timpul depozitării la 4 ° C, a crescut și a atins maxim 56,5 și 62,7 la 4 zile în ambele iaurturi, după care viabilitatea a început să scadă din nou (Figurile 1 și 2).

avium

CFU/ml de MAP în timpul preparării și depozitării refrigerate a iaurturilor Y1 și Y3.


CFU/ml de MAP în timpul preparării iaurturilor Y1 și Y3.
3.2. E coli și S. Enteritidis Numără

Conturile inițiale pentru E coli și S. Enteritidis au fost de 5,3 și 5,5 log de L -1 și au scăzut în prima oră de preparare. Ambele bacterii și-au atins numărul maxim la 24 de ore (6,4 log pentru E coli și 5.3 jurnal de pentru S. Enteritidis). Viabilitatea ambelor bacterii a continuat să scadă ușor până la sfârșitul studiului (5 log pentru E coli și 4.6 jurnal pentru S. Enteritidis) (Figurile 3, 4, 5 și 6).


Jurnalul CFU/ml de E coli și S. Enteritidis în timpul preparării iaurtului și depozitare frigorifică în Y3.


Jurnalul CFU/ml de E coli și S. Enteritidis în timpul preparării iaurtului în Y3.


Jurnalul CFU/ml de E coli și S. Enteritidis în timpul preparării iaurtului și depozitare frigorifică în Y2.


Jurnalul CFU/ml de E coli și S. Enteritidis în timpul preparării iaurtului în Y2.
3.3. pH

PH-ul inițial a fost de 6,1 pentru cei trei iaurturi. În timpul procesului de fermentare, pH-ul a scăzut treptat la 4,5. De la 180 min la 4,5 h, valorile au rămas în acest interval. Ulterior, pH-ul a rămas stabil la 4,5 pe toată durata stocării până la sfârșitul studiului (Figurile 7 și 8).


Evoluția pH-ului în timpul preparării iaurtului și depozitare frigorifică în Y1, Y2 și Y3.


Evoluția pH-ului în timpul preparării iaurtului în Y1, Y2 și Y3.
3.4. Analize statistice

Analiza de regresie a numărului de jurnale de E coli și S. Enteritidis față de timpul de preparare și depozitare în Y3 a dat un

), care arată că variația în pregătirea timpului de depozitare este cauza a 94,25% din variația numărului de bacterii. Prin compararea comportamentului ambelor bacterii, s-au observat diferențe statistice (). În Y2, a fost 0,58 indicând faptul că variația timpului de preparare și depozitare a explicat 58,27% din variația numărului de bacterii. În acest caz, comportamentele ambelor bacterii nu au fost statistic diferite (

). Pe de altă parte, analiza comportamentului E coli în Y3 și Y2 nu a prezentat diferențe semnificative (). In schimb, S. Enteritidis a prezentat un comportament diferit la ambele iaurturi (), care apare în Y3 inoculat cu MAP.

4. Discutie

4.1. Creșterea MAP

Deoarece laptele este un mediu nutritiv potrivit pentru dezvoltarea microorganismelor, laptele crud poate fi o sursă importantă de agenți patogeni pentru oameni. Capacitatea MAP de a supraviețui anumitor metode de procesare a alimentelor și de a persista în condiții nefavorabile, combinată cu posibila sa implicare în boala Crohn, a ridicat îngrijorarea cu privire la expunerea umană la acest agent patogen. Pentru producția comercială de iaurt și alte produse lactate fermentate, laptele crud este de obicei pasteurizat mai întâi. Cu toate acestea, eliminarea completă a MAP prin pasteurizare este încă în dezbatere. Dacă într-adevăr MAP este prezent în laptele pasteurizat, acesta ar putea fi transferat la om la consumul de produse secundare. Prin urmare, este interesant să obțineți informații despre comportamentul MAP în produse precum natura acidă a iaurtului (pH aproximativ 4-4,5) contribuie, în general, la inactivarea agenților patogeni bacterieni [18].

MAP a fost izolat până la sfârșitul prezentului studiu (20 de zile de depozitare), arătând capacitatea sa de a rezista condițiilor acide generate în timpul preparării iaurtului și temperaturilor scăzute de depozitare. În toate eșantioanele, numărul MAP a fost scăzut datorită etapei agresive de decontaminare. van Brandt și colab. [18] au constatat că numărul inițial de MAP rămâne neschimbat pe parcursul celor 6 săptămâni de depozitare frigorifică, indiferent de cultura inițială utilizată și de conținutul de grăsime din lapte, dar nu a evaluat izolarea acestuia în timpul preparării. Sung și Collins [29] au constatat că la niveluri scăzute de pH in vitro, MAP a exprimat două proteine ​​legate de toleranța la acid. Cu toate acestea, ei nu au putut prezice curba de supraviețuire MAP în alimentele în care alți factori ar putea afecta viabilitatea acestuia. În lucrarea de față, MAP nu a fost izolat în timpul procesului de preparare, ceea ce sugerează că scăderea bruscă a pH-ului ar fi putut provoca daune bacteriilor și, prin urmare, a fost imposibil să se cultive pe medii de cultură artificiale. Mai mult, MAP a fost recuperat la 4,5 ore după inoculare, sugerând că inițial ar fi putut fi într-o stare viabilă necultivabilă și după o perioadă de adaptare.

Într-o lucrare anterioară, în timpul preparării și depozitării brânzeturilor obținute cu lapte de caprine și bovine, MAP a fost izolat numai atunci când laptele nepasteurizat a fost utilizat până la 60 de zile de maturare. S-au observat valori ridicate ale pH-ului între 30 și 45 de zile de stocare, coincizând cu izolarea MAP suplimentară [30]. De asemenea, s-a observat că pH-ul, temperatura și concentrațiile de sare pot afecta viabilitatea MAP [31-33].

4.2. Creșterea E coli și S. Enteritidis
4.2.1. Pregătirea
4.2.2. Depozitare

Ar trebui efectuate studii suplimentare pentru a evalua mecanismele competitive de inhibare a acestor agenți patogeni in vitro precum și rezistența lor la diferite temperaturi și niveluri de pH pentru a îmbunătăți condițiile optime pentru prelucrarea produselor lactate și pentru a asigura eliminarea acestora.

5. Concluzii

Prezentul studiu prezintă dovezi că bacteriile patogene precum MAP, E coli, și S. Enteritidis poate supraviețui condițiilor de fermentare a iaurtului și nivelurilor scăzute de pH, urmate de depozitare frigorifică timp de cel puțin 20 de zile. Astfel, acești agenți patogeni sunt prezenți în materiile prime și ar putea ajunge la consumatori. Se evidențiază importanța implementării unor bune practici de fabricație în timpul producției și depozitării iaurtului. Prin urmare, ar trebui efectuate studii similare cu diferite concentrații de bacterii, în încercarea de a simula contaminarea naturală.

Confirmare

Studiul a fost susținut de un proiect (AESA 202831) al Institutului Național de Tehnologie Agricolă (INTA) din Argentina.

Referințe