Haizhi Huang

1 Colegiul de Inginerie Biosisteme și Știința Alimentelor, Institutul Fuli de Știință Alimentară, Universitatea Zhejiang, China

2 Colegiul de Științe, Tehnologie și Matematică, Universitatea Alderson Broaddus, Philippi, WV 26416, SUA

Allen Y. Chen

3 Departamentul de științe farmaceutice, West Virginia University, Morgantown, WV 26506, SUA

Yon Rojanasakul

3 Departamentul de științe farmaceutice, West Virginia University, Morgantown, WV 26506, SUA

Xingqian Ye

1 Colegiul de Inginerie Biosisteme și Știința Alimentelor, Institutul Fuli de Știință Alimentară, Universitatea Zhejiang, China

Gary O. Rankin

4 Departamentul de farmacologie, fiziologie și toxicologie, Școala de medicină Joan C. Edwards, Universitatea Marshall, Huntington, WV 25755, SUA

Yi Charlie Chen

2 Colegiul de Științe, Tehnologie și Matematică, Universitatea Alderson Broaddus, Philippi, WV 26416, SUA

Abstract

Galangina și miricetina sunt flavonoide izolate din legume și fructe care prezintă activitate anti-proliferativă în celulele canceroase umane. În acest studiu, efectele lor anti-angiogenice au fost investigate cu modele in vitro (HUVEC) și in vivo (CAM), care au arătat că galangina și myricetina inhibă angiogeneza indusă de celulele OVCAR-3. Au fost, de asemenea, studiate mecanismele moleculare prin care galangina și miricetina suprimă angiogeneza. S-a observat că galangina și myricetina au inhibat secreția factorului de creștere endotelial vascular (VEGF) al mediatorului angiogenezei cheie și a scăzut nivelul proteinelor p-Akt, p-70S6K și factorului inductibil al hipoxiei-1α (HIF-1α) în A2780/CP70 și Celule OVCAR-3. Experimentele de transfecție tranzitorie au arătat că galangina și miricetina inhibă secreția de VEGF prin calea Akt/p70S6K/HIF-1α. Mai mult, sa descoperit că o cale nouă, p21/HIF-1α/VEGF, este implicată în efectul inhibitor al miricetinei asupra angiogenezei în celulele OVCAR-3. Aceste date sugerează că galangina și miricetina ar putea servi drept potențiali agenți anti-angiogenici în prevenirea cancerelor ovariene dependente de rețelele de vase de sânge noi.

1. Introducere

Studii recente s-au concentrat asupra activității anti-cancer a flavonoidelor izolate din plante (Park și colab., 2014; Zhang și colab., 2014; Zivkovic și colab., 2014). Flavonoidele sunt polifenoli naturali prezenți în multe alimente diferite, în special fructe și legume. Studiile anterioare au sugerat că flavonoidele prezintă caracteristici anticancerigene și ar putea să reducă riscul de cancer prin mecanismele de prevenire a oxidării și inflamației, diminuarea angiogenezei și proliferării celulare și inducerea apoptozei (Gates și colab., 2009; Kandasamy și Ashokkumar, 2013; Li și colab., 2009; Li, Wang, Guo, Zhao și Ho, 2014; Ma și colab., 2014; Yu și colab., 2014). Galangin și myricetin sunt membri ai subclasei flavonolului flavonoidelor cu activități antioxidante. Galangin a fost izolat de rizomul galangal și propolis. Myricetina este mai frecventă decât galangina și se găsește în fructe, legume, nuci, fructe de pădure, ceai și vin roșu (Basli și colab., 2012; Ross și Kasum, 2002).

Angiogeneza este un proces fiziologic prin care se formează noi vase de sânge din vase preexistente (Birbrair și colab., 2014). Este, de asemenea, pasul fundamental în tranziția tumorilor, inclusiv a tumorilor ovariene, de la o stare benignă la una malignă. Angiogeneza este de obicei în repaus în țesuturile adulte normale (Bertl, Bartsch și Gerhauser, 2006). Un microtumor care crește peste 1 până la 2 mm 2 se confruntă cu o alimentație limitată și aport de oxigen și necesită un sistem de sânge intact pentru a-și susține propria creștere și a vărsa metaboliți (Bertl, Bartsch și Gerhauser, 2006). În schimb, adulții fără tumori nu au nevoie de angiogeneză în situații normale (Fotsis și colab., 1993; Glade-Bender, Kandel și Yamashiro, 2003). S-a raportat că anti-angiogeneza este fezabilă pentru tratarea cancerelor umane și a devenit una dintre cele mai promițătoare strategii în chimioprevenție și tratamentul cancerelor. Aceste tumori mici în stadiu incipient nu pot fi diagnosticate cu succes, dar dezvoltarea lor continuă necesită o nouă rețea de vase de sânge (Sanchez-Munoz, Perez-Ruiz, Mendiola, Alba și Gonzalez-Martin, 2009). Studiile anterioare au raportat că galangina și miricetina scad angiogeneza în celulele endoteliale ale venei ombilicale umane (HUVEC) (Kim, Liu, Guo și Meydani, 2006). Myricetina a inhibat, de asemenea, angiogeneza într-un model de tumorigeneză a pielii fără șir SKH-1 indusă de UVB (Jung și colab., 2010).

Factorul de creștere endotelial vascular (VEGF) joacă un rol central în medierea dezvoltării și întreținerii vasculare tumorale (Hefler și colab., 2007). Prin urmare, terapiile anti-VEGF sunt importante în tratamentul cancerelor. Gena VEGF este reglată direct de factorul 1α inductibil de hipoxie (HIF-1α), o proteină heterodimerică de bază elică-buclă-helix (Forsythe și colab., 1996). Stabilizarea și reglarea în sus a HIF-1α promovează expresia VEGF prin legarea la elementele HIF-responsive (HRE) din promotori. Proteina ribozomală S6 kinază (p70S6K), o serină/treonină kinază care acționează în aval de calea PI3K/Akt, controlează angiogeneza prin reglarea proteinelor HIF-1α și VEGF (Bian, Shi, Meng, Jiang, Liu și Jiang, 2010). Akt este un mediator al VEGF care îmbunătățește angiogeneza patologică și creșterea tumorii asociate cu anomalii ale matricei la nivelul pielii și vaselor de sânge (Chen și colab., 2005; Somanath, Razorenova, Chen și Byzova, 2006). P21, cunoscut ca un regulator al progresiei ciclului celular, reglează negativ proteina VEGF în unele celule canceroase, inclusiv celulele OVCAR-3 (Farhang, Goossens, & Haigh, 2013; Luo, Rankin, Juliano, Jiang și Chen, 2012).

În acest studiu, efectele galanginei și miricetinei asupra reducerii angiogenezei au fost examinate în două linii celulare de cancer ovarian rezistente la platină: A2780/CP70 și OVCAR-3. De asemenea, au fost investigate mecanismele implicate în efectele galanginei și miricetinei asupra angiogenezei.

2. Materiale și metode

2.1. Cultura celulelor și reactivi

2.2. Proliferarea celulelor

Inhibarea creșterii celulare a fost determinată cu un kit „CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay” de la Promega (Madison, WI, SUA). Celulele au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la o densitate de 2 × 104/godeu și incubate la 37 ° C. Celulele au fost lăsate să se atașeze la fund peste noapte și apoi tratate cu diferite concentrații de galangină/miricetină. Celulele de control au primit doar un volum egal de DMSO. După 24 de ore, la fiecare godeu s-au adăugat 100 μL CellTiter 96 AQueous One Solution Reactiv diluat (80 μL PBS + 20μL CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent). Celulele au fost apoi incubate la 37 ° C pentru încă o oră și măsurate la 490 nm. Viabilitatea celulară a fost exprimată ca procent de control din trei experimente independente.

2.3. ELISA pentru VEGF

Nivelurile de VEGF în supernatantele de cultură celulară au fost analizate printr-un kit de imunoanaliză VEGF uman Quantikine (R&D Systems, Minneapolis, MN, SUA). Celulele A2780/CP70 și OVCAR-3 (2 × 104/godeu) au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri și incubate peste noapte. Ulterior, celulele au fost tratate cu galangină/miricetină sau DMSO timp de 24 de ore în mediu fără ser. Au fost colectate supernatante de cultură. Cantitățile de VEGF au fost măsurate urmând instrucțiunile producătorului, normalizate la nivelurile totale de proteine ​​și exprimate ca procent din controlul netratat.

2.4. Testul angiogenezei in vitro

Celulele canceroase OVCAR-3 au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la 2 × 104/godeu și incubate peste noapte înainte de tratament cu diferite concentrații de galangină/miricetină timp de 24 de ore. Mediul condiționat a fost colectat. Factorii de creștere reduși Matrigels (BD Biosciences, San Jose, CA, SUA) au fost adăugați în plăci cu 96 de godeuri la 50 μL/godeu și incubate la 37 ° C timp de 30 de minute până la gel. Celulele HUVEC au fost recoltate în mediu bazal de celule vasculare și însămânțate în paturi Matrigel la o concentrație de 1,5 × 10 4/90 μL mediu. Apoi, 10 μL de mediu condiționat colectat au fost adăugați la fiecare godeu și apoi incubate la 37 ° C timp de 6 ore. Fiecare fântână a fost fotografiată la microscop. Fiecare imagine de 1388 × 1040 pixeli a fost în continuare împărțită în 6 zone dreptunghiulare prin linii de rețea pentru a obține lungimea tubului utilizând software-ul NIH ImageJ. Angiogeneza a fost evaluată prin normalizarea lungimii tubului la cea a martorului.

2.5. Test de angiogeneză in vivo

Ouăle de pui fertile specifice fără patogeni (Charles River Laboratories, North Franklin, CT, SUA) au fost incubate la 37,5 ° C și rotite încet de un turnator automat de ouă (G.Q.F. Manufacturing Company, Savannah, GA, SUA). Celulele OVCAR-3 (1,2 × 106 celule într-un mediu fără FBS de 20 μL) au fost amestecate cu 80 μL de Matrigel (BD Bioscience), suplimentate cu diferite concentrații de galangină/miricetină, pre-gelificate pe un covor de silicon autoclavat pentru 30 min și implantat în membrana corioalantoică (CAM) a embrionului de pui de 9 zile. După incubarea a încă 5 zile, implanturile tumorale și vasele de sânge au fost fotografiate și numărate pentru ramificarea vaselor de sânge de către trei anchetatori orbi la tratament. Angiogeneza a fost evaluată prin normalizarea numărului de nave ramificate la cel al controlului CAM.

2.6. Western blot

Celulele cancerului ovarian (10 6) au fost însămânțate în vase de 60 mm și incubate peste noapte înainte de tratamentul cu galangină/miricetină sau DMSO timp de 24 de ore. Celulele au fost spălate cu PBS, lizate în 100 μl de reactiv de extracție a proteinelor de mamifer, inclusiv 1 μL Halt Protease, 1 μL inhibitor de fosfatază și 2 μL acid eathylenediaminetetraacetic (EDTA) (M-PER, Pierce, Rockford, IL, SUA), conform instrucțiunilor producătorului instrucțiuni. Nivelurile totale de proteine ​​au fost testate cu un kit de testare a proteinelor BCA (Pierce). Lizatele celulare au fost separate cu SDS-PAGE 10% și șterse pe o membrană de nitroceluloză cu un sistem Mini-Protean 3 (Bio-Rad, Hercules, CA, SUA). Membranele au fost blocate în lapte degresat 5% în soluție salină tampon Tris conținând 0,1% Tween-20 timp de 1 oră la temperatura camerei. Membranele au fost incubate cu diluțiile adecvate ale anticorpilor primari și anticorpilor secundari. După spălare cu TBST, complexul antigen-anticorp a fost vizualizat cu substratul SuperSignal West Dura Extended Duration Substrat (Pierce). Benzile de proteine ​​au fost cuantificate cu software-ul NIH ImageJ, normalizate prin GAPDH corespunzătoare pentru analiză.

2.7. Transfecție cu ARN interferent mic (siARN)

Celulele OVCAR-3 au fost însămânțate în vase de 60 mm la 5 × 105/vas și incubate peste noapte înainte de transfecție cu p21 siARN sau siARN control (Santa Cruz Biotechnology) folosind ADN jetPRIME ™ și reactiv de transfecție siARN (VWR International, Radnor, PA, SUA) conform protocolului producătorului. După 24 de ore, celulele au fost tratate cu miricetină sau DMSO. Lizatele celulare au fost colectate pentru Western blot pentru a testa proteinele p70S6K, Akt și HIF-lα.

2.8. Transfecția plasmidei și testul luciferazei

Celulele OVCAR-3 au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri la 10.000 de celule/godeu și incubate peste noapte. Celulele OVCAR-3 au fost transfectate cu plasmide Akt, p70S6K/HIF-lα sau SR-α (ca vehicul) și reporter de luciferază HIF-1α/VEGF utilizând reactivul de transfecție ADN jetPRIME ™ și siRNA (VWR International) conform producătorului protocol. La patru ore după transfecție, mediile au fost îndepărtate și urmate de un tratament de 24 de ore cu galangină/miricetină. Celulele au fost recoltate și analizate pentru activități de luciferază cu sistemul ONE-Glo Luciferase Assay System (Promega) și detectate de Lumat LB9507 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germania). Nivelurile totale de proteine ​​au fost analizate cu un kit de testare a proteinelor BCA (Pierce), iar activitățile reporterului au fost normalizate prin nivelurile totale de proteine ​​corespunzătoare pentru analiza statistică.

2.9. Test mic de luciferază de transfecție cu ARN interferent (siARN)

Celulele cancerului ovarian OVCAR-3 (5000 celule/godeu) au fost însămânțate în plăci cu 96 de godeuri și incubate peste noapte. Celulele au fost transfectate cu siRNA p21 sau siRNA de control și apoi transfectate cu reporter luciferază HIF-1α/VEGF timp de 24 de ore utilizând reactivul de transfecție ADN jet și PRIM siRNA (VWR International) conform protocolului producătorului. Mediile au fost îndepărtate și urmate de un tratament de 24 de ore cu galangină/miricetină. Celulele au fost recoltate și analizate pentru activități de luciferază cu sistemul ONE-Glo Luciferase Assay System (Promega) și detectate de Lumat LB9507 (Berthold Technologies). Nivelurile totale de proteine ​​au fost analizate cu un kit de testare a proteinelor BCA (Pierce), iar activitățile reporterului au fost normalizate prin nivelurile corespunzătoare de proteine ​​totale pentru analiza statistică.

2.10. analize statistice

Toate experimentele au fost efectuate de cel puțin trei ori independent. Rezultatele au fost exprimate ca medie ± eroare standard a mediei (SEM) utilizând Microsoft Excel (2007). Evaluarea statistică a fost efectuată cu sistemul de programe SPSS (versiunea 18.0 pentru Windows). Rezultatele au fost analizate folosind analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) și testul post hoc (testul Dunnett pe două fețe) pentru a testa atât diferențele generale, cât și diferențele specifice dintre fiecare tratament și control. O valoare p mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă.

3. Rezultate

3.1. Efectul galanginei și miricetinei asupra viabilității celulelor cancerului ovarian

myricetin

Celulele OVCAR-3 au fost însămânțate (2 × 104), tratate cu concentrații variate de galangină sau miricetină timp de 24 de ore și apoi mediul a fost colectat. Celulele HUVEC au fost recoltate, numărate și însămânțate pe paturile Matrigel gelificate. Au fost adăugate mediile de cultură celulară condiționate colectate și celulele au fost incubate timp de 6 ore.

3.4. Galangina și miricetina inhibă angiogeneza in vivo indusă de celulele OVCAR-3

(A) Galangin a scăzut nivelurile de HIF-1 α, fosfor-Akt, fosfor-P70S6K și nu a avut niciun efect asupra NFκB și PTEN în A2780/CP70 și OVCAR-3. (B) Myricetinul a scăzut nivelurile de HIF-1α, fosfor-Akt, fosfor-p70S6K și nu a avut niciun efect asupra NFκB și PTEN în A2780/CP70 și OVCAR-3. Benzile proteice au fost normalizate prin benzile GAPDH corespunzătoare (p-Akt/p-p70S6K au fost normalizate prin t-Akt/t-p70S6K) și au fost exprimate ca procente de control. * p # p Figura 5C). Apoi, celulele OVCAR-3 au fost transfectate cu reporterul HIF-1α împreună cu plasmide p70S6K și Akt. Tratamentul cu Galangin a inhibat semnificativ activitatea transcripțională a HIF-1α; cu toate acestea, această inhibiție a fost atenuată semnificativ prin supraexprimarea proteinelor p70S6K și Akt (Figura 5C). În mod similar, miricetina a inhibat în mod semnificativ activitățile transcripționale HIF-1α și VEGF în celulele OVCAR-3. Supraexprimarea dependentă de concentrație a proteinelor p70S6K și Akt a inversat semnificativ această inhibare (Figura 5D). Aceste rezultate indică faptul că galangina și miricetina inhibă angiogeneza în celulele OVCAR-3, cel puțin parțial, prin scăderea nivelurilor de HIF-1α, Akt și p70S6K.

3.6. Rolul p21 asupra angiogenezei inhibate de myricetin în celulele OVCAR-3

P21, ca regulator al progresiei ciclului celular, a fost raportat că inhibă expresia VEGF în celulele OVCAR-3 (Luo, Rankin, Juliano, Jiang și Chen, 2012). Prin urmare, unele proteine ​​care sunt asociate cu p21 au fost examinate pentru a clarifica dacă myricetinul inhibă viabilitatea în celulele OVCAR-3 prin intermediul proteinei p21 (Figura 6A). S-a constatat că nivelurile de myricetin reglate în sus ale proteinelor p21 și p53 și nivelurile reglate în jos ale proteinei oncogene cmyc.

(A) Myricetinul a scăzut nivelurile de cmyc și a crescut expresia p21 și p53 în OVCAR-3. Benzile de proteine ​​au fost normalizate prin benzile GAPDH corespunzătoare și exprimate ca procente de control. * p # p Figura 6B prezintă eliminarea p21 de către ARNsi specific (50 nM) a dus la abrogarea activităților transcripționale HIF-1α și VEGF inhibate de miricetin. După cum arată rezultatul western blot, transfecția cu p21 siARN a crescut nivelurile de proteină HIF-1α în celulele OVCAR-3 tratate cu și fără myricetin. Din aceste rezultate, s-a dedus că p21/HIF-1α/VEGF este una dintre căile implicate în angiogeneza inhibată de myricetin în celulele OVCAR-3. Cu toate acestea, rezultatele din western blot au arătat că eliminarea p21 nu a abrogat efectul miricetinei asupra nivelului proteinelor p-Akt și p-p70S6K în celulele OVCAR-3 (Figura 6C).

4. Discutie

Tumorile au nevoie de un sistem sanguin intact pentru a furniza substanțe nutritive și oxigen și pentru a elimina metaboliți (Bertl, Bartsch și Gerhauser, 2006). Angiogeneza este un proces fiziologic prin care se formează noi vase de sânge din vase preexistente (Birbrair și colab., 2014). Este o condiție necesară pentru o creștere tumorală susținută și joacă un rol central în dezvoltarea și progresia cancerelor. Tumorile ovariene sunt bogat vascularizate, iar gradul de neovascularizare și angiogeneză este asociat cu agresivitatea biologică (Alvarez, Krigman, Whitaker, Dodge și Rodriguez, 1999). În această cercetare, galangina și miricetina au inhibat în mod eficient formarea rețelelor de vase de sânge induse de celulele cancerului ovarian. În modelul CAM, tratamentul cu galangină și miricetină a micșorat semnificativ numărul vaselor de sânge, confirmând potența lor în contracararea angiogenezei.