X.J. Li, B. Li 1 *, J.S. Huang, J.M. Shi 1, W. Fan 1 și Y.L. Zhou *
Departamentul de Sănătate în Muncă, China
1 Laborator Central, Spitalul Jinshan, Universitatea Fudan, Nr. 1508, Longhang Road, districtul Jinshan, Shanghai, 201508, China

Data înscrierii 28 mai 2016
Data revizuirii 01 septembrie 2016
Data acceptării 11 septembrie 2016
Indian J Pharm Sci 2016; 78 (5): 591-601

Acesta este un articol cu ​​acces liber distribuit în condițiile licenței Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0, care permite altora să remixeze, să modifice și să construiască pe lucrare necomercial, atât timp cât autorul este creditat și noile creații sunt licențiat în condiții identice.

DOI: 10.4172/pharmaceut-sciences.1000157

Abstract

Cuvinte cheie

Acrilonitril, proteină TLR4, splină, tiosulfat de sodiu

Am efectuat anterior cercetări privind toxicitatea ACN asupra organelor endocrine, nervoase și reproductive, asupra efectelor sale asupra îmbătrânirii și așa mai departe. Unele alte investigații epidemiologice asupra imunotoxicității ACN din studiile pe animale au confirmat că ACN poate afecta limfocitele și splina, în timp ce mecanismul de imunotoxicitate cauzat de ACN rămâne neclar, ceea ce merită un studiu aprofundat suplimentar. În ultimii ani, s-a descoperit că receptorii de taxare (Toll as Receptor, TLR) sunt receptori transmembranari importanți implicați în transducția semnalului legată de imunitatea înnăscută. Acestea sunt exprimate în principal pe suprafața celulelor care prezintă antigen (APC) și a altor celule asociate cu imunitatea înnăscută, cum ar fi neutrofilele, mastocitele, bazofilele și eozinofilele. Aceștia inițiază transducția semnalului, duc la secreția mediatorilor inflamatori și joacă roluri importante în apărarea imună naturală [6-8]. Conceptul emergent al TLR-urilor ca molecule cheie care modelează eficacitatea răspunsurilor imune împotriva microbilor este susținut în continuare de experimente în care șoarecii lipsiți de MyD88 sunt incapabili să dezvolte răspunsuri Th1 specifice antigenului [9].

TLR4 este un subtip al familiei TLR, care se exprimă în principal pe suprafața celulelor care prezintă antigen și pe suprafața celulară a neutrofilelor, mastocitelor, bazofilelor etc. Studiile privind transducția semnalului mediată de receptorul de celule T au arătat că proteina TLR4 de pe limfocitele prezente în splină și unele citokine au fost susceptibile de a juca roluri critice în căile de transducție a semnalelor care controlează și modulează răspunsurile imune. În mod corespunzător, neutralizarea mai multor mediatori imuni precum interferonul (IFN) sau factorul de necroză tumorală (TNF), inhibarea oxidului azotic sintaz inductibil (iNOS) sau epuizarea celulelor T, duce la focare de infecții [10]. Prin urmare, o rețea continuă de acțiuni, cel mai probabil în concordanță cu celulele T activate, poate fi necesară pentru a genera răspunsuri imunologice active. Pe baza realizărilor cercetărilor anterioare și a cunoștințelor despre TLR menționate mai sus, presupunem că activarea receptorilor de recunoaștere a modelelor patogene (PRR), cum ar fi TLR și alți receptori, poate declanșa o cascadă de activități celulare, inclusiv eliberarea unor factori proinflamatori, astfel încât cantitatea de TLR este legat de gradul de deteriorare a organelor și de gradul de inflamație care rezultă ca fiind expus la materiale toxice precum ACN.

Materiale și metode

Studiul a fost realizat în conformitate cu Ghidul Institutelor Naționale de Sănătate pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de Laborator și efectuat cu toate eforturile pentru a reduce la minimum numărul de animale implicate și suferințele lor. Șobolani Sprague Dawley de sex masculin (vechi de 12 w) au fost achiziționați de la Shanghai Silaike Company of China și adăpostiți în grup (4 sau 5 pe cușcă) în cameră controlată de temperatură (20 ± 1 °) și umiditate (55 ± 5%), sub un inversat 12 h ciclu zi/noapte.

ACN a fost furnizat de Shanghai SSS Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). Anticorpul monoclonal TLR4/β-actină a fost furnizat de Santa Cruz (SUA). Anticorpii secundari împotriva peroxidazei de ridiche de cal și markeri proteici preconizați au fost oferiți de Millipore (Billerica, MA, SUA). Reactivul Trizol a fost furnizat de Invitrogen Corporation, SUA. Vopseaua fluorescentă SYBR a fost achiziționată de la Roche (Germania).

Proiectare experimentală

Diagrama de flux experimental a fost prezentată în diagrama atașată mai jos (smochin. 1). Șaptezeci de șobolani au fost împărțiți în mod aleatoriu în șapte grupuri: Con, ACN-L, ACN-M, ACN-H, SCN-L, SCN-M și SCN-H (n = 10 pentru fiecare grup; L, M, H reprezentând scăzut, concentrație medie și mare de ACN sau SCN). Șobolani din grupurile ACN (inclusiv grupul ACN-L, ACN-M și ACN-H) au fost zilnic gavate cu ACN timp de 4 săptămâni. Șobolanilor din grupul Con li s-a administrat soluție salină prin gavaj în loc de ACN timp de 4 w, în timp ce șobolanii din grupurile SCN (inclusiv grupul SCN-L, SCN-M și SCN-H) au fost în primul rând gavate cu ACN 10 mg/kg/zi (adică concentrația medie de ACN aplicat în studiul nostru) timp de 3 w și mai târziu de la 4 a w, aceste șobolani au fost injectați zilnic intraperitoneal cu SCN de concentrații diferite, în plus față de gavajul zilnic de ACN (10 mg/kg/zi).

după

FIG. 1: Schema pentru a arăta procedurile experimentale pentru diferite grupuri.
Toți șobolanii implicați în experiment au fost împărțiți în mod aleatoriu în șapte grupuri: Con, ACN-L, ACN-M, ACN-H, SCN-L, SCN-M și SCN-H (n = 10 pentru fiecare grup). Șobolanii din grupurile ACN (inclusiv grupul ACN-L, ACN-M și ACN-H) au fost zilnic gavate cu ACN cu concentrații diferite, corespunzătoare concentrației de 5, 10 și 20 mg/kg/zi, respectiv timp de 4 săptămâni. Șobolanilor din grupul Con li s-a administrat numai soluție salină prin gavaj zilnic timp de 4 săptămâni, în timp ce șobolanilor din grupurile SCN (inclusiv grupul SCN-L, SCN-M și SCN-H) li s-a administrat zilnic injecție intraperitoneală (ip) de SCN de 0,05, 0,1 și 0,2 concentrația de g/kg/zi, respectiv, numai pentru a 4-a săptămână, în plus față de o cantitate zilnică de ACN de 10 mg/kg/zi din prima până în a patra săptămână.

Histologia splinei și imunohistochimia

Probele de splină au fost preparate în tampon de liză rece cu gheață (50 mM TrisHCI, pH 7,4, 50 mM NaCI, NP-40 1%, Triton X-100 1%, 0,5 mM EDTA, deoxicolat de sodiu 1%) care conținea inhibitori de protează. Proteinele totale au fost separate prin electroforeză în gel denaturant 8% SDS/poliacrilamidă și apoi transferate la o membrană de nitroceluloză Hybond ECL (GE Healthcare Europe, Milano, Italia). După saturarea siturilor de legare nespecifice cu 5% lapte negras în soluție salină tamponată Tris (TBS) 1 × Tween 20 (0,05%), membrana a fost imunoblotată peste noapte la 4 ° cu anticorpul primar împotriva TLR4 (1: 500) și ulterior sondată cu un anticorp secundar anti-capră (1: 1000, Santa Cruz Biotechnology Inc.) peste noapte la 4 °. Membrana a fost decupată (Restore Western Blot Stripping buffer, Pierce Biotechnology, Rockford, IL, SUA) și reimunoblotată cu anticorp primar antiactin (1: 7500), apoi cu anticorpi secundari anti-iepure (1: 5000) Biotechnology Inc. ). Benzile imunoreactive au fost vizualizate prin chemiluminescență îmbunătățită utilizând un kit ECL-plus (GE Healthcare Europe) urmând protocolul producătorului.

Concentrația citokinelor inflamatorii plasmatice

Fiecare șobolan a primit 10% hidrat de clor (0,4 ml/100 g/greutate corporală) pentru anestezie. Probele de sânge au fost colectate din inimile șobolanilor și centrifugate la 2000 rpm timp de 15 minute. Supernatantul a fost colectat și depozitat la –80 ° pentru analiza ulterioară. Citokinele plasmatice proinflamatorii, adică Nivelurile de TNF-α, IL-1β au fost măsurate cu un kit de radioimunotest (RIA) și valorile obținute au fost exprimate ca pg/ml.

analize statistice

Datele cantitative sunt prezentate ca medie ± SEM. Datele au fost analizate utilizând software-ul SPSS versiunea 15.0 pentru Windows (SPSS Inc., Chicago, IL). Analiza statistică a fost efectuată folosind testul t Student sau analiza varianței care este adecvată. Valoarea P 0,05, tabelul 1). Pe de altă parte, după tratamentul cu SCN, greutatea corporală și splinică a șobolanilor a crescut, a existat o diferență semnificativă între ACN-M și orice grup SCN-M (P 0,05).