Annette Brandt

1 Departamentul de Științe Nutritive, Științe Nutriționale Moleculare, Universitatea din Viena, A-1090 Viena, Austria; [email protected] (A.B.); [email protected] (A.J.E.)

2 Institute of Nutritional Sciences, SD Model Systems of Molecular Nutrition, Friedrich-Schiller-University Jena, D-07743 Jena, Germania; moc.liamtoh@2002-ijiat (C.J.J.); ten.xmg@etloNajtaK (K.N.); ed.xmg@nnamlleSnirhtaC (C.S.)

Cheng Jun Jin

2 Institute of Nutritional Sciences, SD Model Systems of Molecular Nutrition, Friedrich-Schiller-University Jena, D-07743 Jena, Germania; moc.liamtoh@2002-ijiat (C.J.J.); ten.xmg@etloNajtaK (K.N.); ed.xmg@nnamlleSnirhtaC (C.S.)

Katja Nolte

2 Institute of Nutritional Sciences, SD Model Systems of Molecular Nutrition, Friedrich-Schiller-University Jena, D-07743 Jena, Germania; moc.liamtoh@2002-ijiat (C.J.J.); ten.xmg@etloNajtaK (K.N.); ed.xmg@nnamlleSnirhtaC (C.S.)

Cathrin Sellmann

2 Institute of Nutritional Sciences, SD Model Systems of Molecular Nutrition, Friedrich-Schiller-University Jena, D-07743 Jena, Germania; moc.liamtoh@2002-ijiat (C.J.J.); ten.xmg@etloNajtaK (K.N.); ed.xmg@nnamlleSnirhtaC (C.S.)

Anna Janina Engstler

1 Departamentul de Științe Nutritive, Științe Nutriționale Moleculare, Universitatea din Viena, A-1090 Viena, Austria; [email protected] (A.B.); [email protected] (A.J.E.)

2 Institute of Nutritional Sciences, SD Model Systems of Molecular Nutrition, Friedrich-Schiller-University Jena, D-07743 Jena, Germania; moc.liamtoh@2002-ijiat (C.J.J.); ten.xmg@etloNajtaK (K.N.); ed.xmg@nnamlleSnirhtaC (C.S.)

Ina Bergheim

1 Departamentul de Științe Nutritive, Științe Nutriționale Moleculare, Universitatea din Viena, A-1090 Viena, Austria; [email protected] (A.B.); [email protected] (A.J.E.)

2 Institute of Nutritional Sciences, SD Model Systems of Molecular Nutrition, Friedrich-Schiller-University Jena, D-07743 Jena, Germania; moc.liamtoh@2002-ijiat (C.J.J.); ten.xmg@etloNajtaK (K.N.); ed.xmg@nnamlleSnirhtaC (C.S.)

Date asociate

Abstract

1. Introducere

Cu o prevalență variind de la

2% la 44% în populația europeană generală și

24% dintre adulții din America de Nord, boala hepatică grasă nealcoolică (NAFLD) este considerată a fi cea mai frecventă boală hepatică din lume până acum [1,2]. NAFLD cuprinde un spectru larg de boli, de la steatoza simplă la steatohepatită, ciroză și, în unele cazuri, chiar la carcinom hepatocelular [3]. Cu toate acestea, în ciuda eforturilor intense de cercetare, mecanismele moleculare care stau la baza dezvoltării NAFLD nu au fost încă clarificate. În consecință, opțiunile de tratament universal acceptate sunt, de asemenea, limitate, iar terapiile care vizează stilul de viață și tiparele dietetice cu rate de recidivă ridicate sunt în continuare strategiile de tratament la alegere [4].

Pornind de la acest context, scopul prezentului studiu a fost de a determina dacă o schimbare pe termen scurt a tiparului alimentar, de exemplu, aportul unei diete bogate în grăsimi, fructoză și colesterol (FFC) timp de doar patru zile, este suficientă pentru a provoca afectarea funcției barierei intestinale și apariția NAFLD. Studiul nostru urmărește în continuare să stabilească dacă un tratament cu doze terapeutice de antibiotice nerezorbabile paralele cu inducerea bolii protejează șoarecii de modificările barierei intestinale, de exemplu, pierderea proteinelor de joncțiune strânsă sau dacă protecția asociată tratamentului cu antibiotice este mai degrabă legată la eliminarea bacteriilor din intestin.

2. Materiale și metode

2.1. Animale și tratament

90% comparativ cu șoarecii tratați de vehicule. Consumul de dietă a fost evaluat zilnic și ajustat între grupuri astfel încât toate grupurile să primească aceeași cantitate de calorii. La sacrificare, șoarecii au fost anesteziați cu un amestec de ketamină (100 mg/kg greutate corporală) și xilazină (16 mg/kg greutate corporală) intraperitoneală. Sângele a fost obținut din vena portală. Porțiuni de ficat și intestin subțire (duoden și jejun) au fost fie înghețate imediat, fixate în formalină cu tampon neutru, înghețate fixate în mediul de montare cu temperatură optimă de tăiere (OCT) (Medite, Burgdorf, Germania) sau depozitate în RNAlater ® la -20 ° C (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania).

administrarea

Rezumatul proiectării studiului. După adaptarea șoarecilor timp de 7 zile la aportul unei diete lichide urmată de 4 zile de pretratament cu antibiotice nerezorbabile (92 mg polimixină B/kg greutate corporală/zi și 216 mg neomicină/kg greutate corporală/zi) sau vehicul = apă) adăugate la dieta de control lichid, șoarecii (n = 6-8/grup) au fost fie hrăniți cu dieta de control lichid, fie cu o dietă bogată în grăsimi, fructoză și colesterol (FFC) ± antibiotice timp de încă 4 zile.

2.2. Evaluarea histologică a secțiunilor hepatice și a acumulării de lipide hepatice

Histologia ficatului a fost evaluată în secțiuni încorporate în parafină (4 μm) colorate cu hematoxilină și eozină (ambele Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania) folosind scorul de activitate NAFLD (NAS) așa cum s-a descris anterior [16]. Secțiunile congelate de ficat fixate în OCT (10 µm) au fost colorate cu roșu ulei O (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania) așa cum s-a descris anterior [17]. Imagini reprezentative ale ambelor colorări au fost surprinse la o mărire de 200 × folosind un sistem încorporat într-un microscop (Leica DM4000 B LED, Leica, Wetzlar, Germania). Pentru a determina numărul de granulocite neutrofile din țesutul hepatic, secțiunile încorporate în parafină (4 μm) au fost colorate folosind un kit de nafthol AS-D cloracetat de esterază disponibil în comerț (Sigma-Aldrich, Steinheim, Germania). Numărul de neutrofile a fost cuantificat conform detaliilor anterioare [13]. Trigliceridele hepatice au fost extrase din întregul țesut hepatic și măsurate așa cum s-a descris anterior [13].

2.3. Parametrii sângelui pentru afectarea ficatului, ELISA și măsurarea endotoxinei

Activitatea transaminazei cu alanină plasmatică (ALT) a fost determinată folosind un test colorimetric într-un laborator de rutină la Spitalul Universitar din Jena, Germania (Arhitect, Abbott GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Germania). Concentrația de proteine ​​a inhibitorului activatorului plasminogen-1 (PAI-1) în omogenizat hepatic a fost determinată folosind un kit de testare a imunosorbentului enzimatic legat de șoarece PAI-1 (ELISA) (LOXO GmbH, Dossenheim, Germania) conform instrucțiunilor producătorului . Nivelurile de endotoxină din plasma portal au fost măsurate cu un test de lizat amebocit limulus disponibil în comerț (Charles River, Ecully, Franța) așa cum s-a descris anterior [13].

2.4. Colorare imunohistochimică pentru 4-HNE Proteine ​​aductive și iNOS Protein în ficat, precum și 3-nitrotozină Proteine ​​aductive, MMP-13, Occludin și ZO-1 Protein în intestinul subțire

2.5. Izolarea ARN și RT-PCR în timp real

ARN din ficat și din țesutul intestinal subțire a fost extras (peqGOLD Trifast, Peqlab, Erlangen, Germania) și ADNc a fost sintetizat utilizând un sistem de transcripție inversă (Promega GmbH, Madison, WI, SUA). Exprimarea acetil-CoA carboxilazei (ACC), a acidului gras sintază (FASN), a interleukinei-1β (Il-1β), a interleukinei-6 (Il-6), a receptorului de tip toll-4 (TLR-4), a stearoil-CoA desaturază-1 (SCD1), proteină de legare a elementelor de reglare a sterolului-1c (SREBP-1c), mNAr de răspuns primar de diferențiere mieloidă 88 (MyD88) mARN în ficat și metaloproteinază-matrice-9 (MMP-9) și mMP-13 în intestinul subțire a fost măsurat utilizând reacția în lanț a polimerazei în timp real (PCR), așa cum s-a detaliat anterior [14]. Exemple de secvențe sunt prezentate în Tabelul 1. Pentru determinarea cantității de gene țintă, a fost utilizată metoda CT comparativă și rezultatele au fost normalizate la referința endogenă 18S și relativ la un calibrator (2 −ΔΔCt).

tabelul 1

Număr de acces GeneForward (5 ′ - 3 ′) Reverse (5 ′ - 3 ′)
18SGTA ACC CGT TGA ACC CCA TTCCA TCC AAT CGG TAG TAG CG > NR_003278
ACCCTT CCT CCT GAT CAG CAA CTC TCGT GAG TTT TCC CAA AAT AAG C > NM_133904
FASNTCT GGG CCA ACC TCA TTG GTGAA GCT GGG GGT CCA TTG TG > NM_007988
Il-1βTGG CTG TGG AGA AGC TGT GGGTC CGA CAG CAC GAG GCT TT > NM_008361
Il-6CCA CGG CCT TCC CTA CTT CATGC AAG TGC ATC ATC GTT GTT C > NM_001314054
iNOSCCC CTG GAA GTT TCT CTT CAA AGT CGAT TCT GGA ACA TTC TGT GCT GTC C > NM_010927
MMP-13AGA AGT GTG ACC CAG CCC TAGCG CAA GAA GAA TCT GTC TTT > NM_008607
MMP-9TGG TCT TCC CCA AAG ACC TGGCG GTA CAA GTA TGC CTC TG > NM_013599
MyD88CAA AAG TGG GGT GCC TTT GCAAA TCC ACA GTG CCC CCA GA > NM_010851
SCD1CCG ATA AAA GGG GGC TGA GGTGC TGA GAT CGA GCG TGG AC > NM_009127
SREBP-1cACC GGC TAC TGC TGG ACT GCAGA GCA AGA GGG TGC CAT CG > NM_001313979
TLR-4AGC CAT TGC TGC CAA CAT CA.GCT GCC TCA GCA GGG ACT TC > NM_021297

ACC: acetil-CoA carboxilaza; FASN: acizi grași sintaza; Il: interleukin; iNOS: oxid de azot inductibil sintază; MMP: metaloproteinază matricială; MyD88: gena de răspuns primar de diferențiere mieloidă 88; TLR: receptor asemănător taxei; SCD1: stearoil-CoA desaturază-1; SREBP-1c: proteina-1c care leagă elementul de reglare a sterolului.

2.6. Western Blot

2.7. Analize statistice