Departamentul de Științe ale Agriculturii, Alimentației și Mediului (SAFE), Universitatea din Foggia, Foggia, Italia
Institutul de Cercetări în Știința Alimentelor, CIAL (CSIC-UAM), Madrid, Spania
Institutul Zoopropilactic Experimental din Apulia și Basilicata, Matera, Italia
Institutul Zoopropilactic Experimental din Apulia și Basilicata, Putignano, Italia
Institutul Zoopropilactic Experimental din Apulia și Basilicata, Putignano, Italia
Institutul Zoopropilactic Experimental din Apulia și Basilicata, Matera, Italia
Departamentul de Științe ale Agriculturii, Alimentației și Mediului (SAFE), Universitatea din Foggia, Foggia, Italia
Corespondenţă
Giovanni Normanno, Departamentul de Științe ale Agriculturii, Alimentației și Mediului (SAFE), Via Napoli 25, Universitatea din Foggia, 71121, Foggia, Italia.
Departamentul de Științe ale Agriculturii, Alimentației și Mediului (SAFE), Universitatea din Foggia, Foggia, Italia
Institutul de Cercetări în Știința Alimentelor, CIAL (CSIC-UAM), Madrid, Spania
Institutul Zoopropilactic Experimental din Apulia și Basilicata, Matera, Italia
Institutul Zoopropilactic Experimental din Apulia și Basilicata, Putignano, Italia
Institutul Zoopropilactic Experimental din Apulia și Basilicata, Putignano, Italia
Institutul Zoopropilactic Experimental din Apulia și Basilicata, Matera, Italia
Departamentul de Științe ale Agriculturii, Alimentației și Mediului (SAFE), Universitatea din Foggia, Foggia, Italia
Corespondenţă
Giovanni Normanno, Departamentul de Științe Agricole, Alimentație și Mediu (SIGUR), Via Napoli 25, Universitatea din Foggia, 71121, Foggia, Italia.
Abstract
O cantitate cunoscută (10 7 cfu/ml) de origine animală rezistentă la meticilină Staphylococcus aureus (MRSA) ST398/t011/V și de origine umană tulpinile MRSA ST1/t127/IVa au fost inoculate individual în ricotta mostre de brânză și hamburger. PH-ul fiecărei matrice alimentare a fost redus treptat de la 6,0 până la 2,0 într-o perioadă de aproximativ 2 ore, în condiții care simulează digestia mecanică a stomacului uman. Ulterior, tulpinile MRSA au fost recuperate utilizând un mediu de placare specific MRSA. Deși ambele tulpini au prezentat o anumită rezistență acidă, au prezentat răspunsuri diferite la valori scăzute ale pH-ului în timpul experimentului: ST398 a supraviețuit nevătămat în timpul experimentelor până la ultima etapă la pH 2, unde numărul de 6,4 cfu/g pentru hamburger și 7,5 jurnal cfu/g pentru ricotta s-au obținut teste de brânză. În schimb, populația ST1 nu mai era detectabilă la pH 3 în hamburger și la pH 2 în ricotta teste de brânză. Din câte știm, acesta este primul studiu care investighează capacitatea MRSA de a depăși condițiile acide ale stomacului uman și care adaugă noi dovezi care ar putea contribui la extinderea cunoștințelor științifice cu privire la semnificația MRSA în dezbaterea siguranței alimentare.
Repere
- Studiul descrie pentru prima dată soarta MRSA umană și animală, inoculată în diferite matrice alimentare, în condiții acide simulate ale stomacului uman.
- Studiul oferă informații despre supraviețuirea MRSA în condiții acide ale stomacului uman, care ar putea fi utile în scopuri de siguranță alimentară.
- Cele două tulpini de MRSA utilizate în acest studiu arată comportamente diferite în condiții experimentale.
1. INTRODUCERE
Este larg recunoscut faptul că o aciditate gastrică normală poate oferi o apărare importantă a gazdei împotriva agenților patogeni ingerați prin uciderea acestor microorganisme, așa cum s-a demonstrat anterior pentru mai mulți bacili gram negativi și celule vegetative ale Clostridium difficile, Mycobacterium avium, precum și pentru agenții patogeni nosocomiali, cum ar fi Candida albicans, Rezistent la meticilină Staphylococcus aureus (MRSA), rezistent la vancomicină Enterococ spp. (VRE) și cu spectru extins - producător de β - lactamază Enterobacteriaceae (Bodmer, Miltner și Bermudez, 2000; Donskey, 2004; Rao, Jump, Pultz, Pultz și Donskey, 2006).
O serie de studii au examinat răspunsurile adaptive ale S. aureus expus la stres acid în alimentele fermentate (Bore, Langsrud, Langsrud, Rode și Holck, 2007; Rode și colab., 2010). Cu toate acestea, sunt disponibile puține informații cu privire la capacitatea condițiilor acide ale stomacului uman de a ucide MRSA ingerat. Scopul acestui studiu a fost de a evalua supraviețuirea a două tulpini MRSA incluse în două alimente de origine animală expuse mediului stomacului uman prin simularea condițiilor de acid gastric și a digestiei sale mecanice.
2 MATERIAL ȘI METODE
2.1 Pregătirea rezistentei la meticilină S. aureus (MRSA) inocul
O tulpină MRSA ST398/t011/V, anterior izolată din laptele de vacă crud, și o tulpină MRSA ST1/t127/IVa, izolată anterior din tampoane nazale umane (Parisi și colab., 2016), au fost suspendate individual în 5 ml de bulion BHI (pre-inoculum) și incubat la 37 ° C timp de 24 de ore. Cultura MRSA a fiecărei tulpini a fost preparată prin resuspendarea, pentru fiecare, a 20 pl din pre-inocul în 5 ml de bulion proaspăt de BHI incubat la 37 ° C timp de 24 de ore. Concentrația MRSA a fiecărui inocul utilizat în experimentul de aciditate gastrică simulată a fost de 5 ml × 107 cfu/ml conform standardului McFarland.
2.2 Pregătirea matricilor alimentare
Mediul alimentat a fost preparat așa cum a fost descris anterior de Barroso, Cueva, Peláez, Martínez - Cuesta și Requena (2015). Mediul conținea arabinogalactan (1 g/L), pectină din măr (2 g/L), xilan (1 g/L), amidon de cartofi (3 g/L), glucoză (0,4 g/L), extract de drojdie (3 g/L), peptonă (1 g/L), mucină (4 g/L) și L-cisteină (0,5 g/L). Odată ce pulberile au fost dizolvate, amestecul a fost apoi autoclavizat și pH-ul a fost ajustat până când a atins valoarea de 6,5.
Două alimente de origine animală, ricotta brânză și hamburger, au fost utilizate în experimente. Pentru a exclude părtinirea în rezultate, fiecare matrice alimentară a fost testată înainte de experiment pentru prezența S. aureus și MRSA utilizând protocolul descris de Parisi și colab. (2016).
Pentru prepararea suspensiei experimentale (ES) utilizate în acest studiu, cincizeci de grame din fiecare matrice alimentară au fost adăugate individual la 50 ml mediu alimentat la 37 ° C și omogenizate timp de 10 minute la 230 RPM folosind un stomacher la temperatura camerei. În cele din urmă, s-au adăugat 5 ml din fiecare inocul MRSA (5% din volum) la fiecare dintre cele două ES preparate.
2.3 Experiment de aciditate gastrică
Experimentul acid gastric simulat a fost efectuat așa cum este descris de Haffner, van de Wiele și Pasc (2017) cu ușoare modificări. Pe scurt, pH-ul probelor a fost redus treptat pe o perioadă de aproximativ 2 ore și omogenizat periodic utilizând un stomacher care imită digestia mecanică a stomacului (Haffner și colab., 2017; Maisanaba și colab., 2018). În detaliu, după inocularea MRSA în fiecare ES preparat și prima sa omogenizare (230 RPM timp de 10 minute) într-o pungă stomacher, pH-ul ricotta brânza și hamburgerul (stabilizat la pH 6,0 începând de la pH 6,5 și respectiv 5,8 pH) au fost reduse în etape de la 6,0 (T0) la 2,0 (T4) prin adăugarea unei cantități specifice de HCl 1 M (de la 0,5 la 19 ml). Fiecare probă a fost agitată timp de 2 minute la temperatura camerei și incubată la 37 ° C timp de 15 minute în fiecare punct al experimentului (T1 - T3), cu excepția ultimului (T4), când au fost incubate timp de 30 de minute la 37 ° C, după cum sugerează Haffner și colab. (2017). Pentru fiecare experiment alimentar, 50 ml de mediu hrănit inoculat cu fiecare tulpină MRSA a fost utilizat ca martor. Fiecare martor a avut același pH inițial ca echivalentul matricei sale alimentare și ambii au fost prelucrați în condițiile menționate mai sus. Fiecare experiment a fost realizat de două ori.
2.4 Numărul MRSA
Diluțiile seriale corespunzătoare în apă peptonică din fiecare probă la fiecare timp de prelevare, de la T0 (timpul inoculului) la T4 (pH 2), au fost însămânțate pe plăci de MRSA - SELECT ® (BioRad) și incubate la 37 ° C timp de 24 de ore. Pentru a evalua variația rezistenței acide a fiecărei tulpini MRSA în timpul experimentului, în fiecare etapă a scăderii valorilor pH-ului (de la T0 la T4) atât în matrice, cât și în martori, coeficientul de variație (CV) %) a fost utilizat.
2.5 Numărul total de bacterii (TBC)
Pentru a evalua eficacitatea procedurii, a fost evaluat efectul acidificării asupra bacteriilor totale ale ambelor matrice alimentare utilizate în studiu. În detaliu, s-a efectuat un număr total de colonii bacteriene (TBC) pe ambele neinoculate ricotta brânză și hamburger în trei puncte diferite în timpul experimentului: la T0 (pH 6), la T2 (pH 4), la T4 (pH 2) folosind un Agar Plate Count (Microbiol) conform protocolului raportat în ISO 4833– 1: 2013 .
3. REZULTATE
3.1 Contează MRSA
Numărul MRSA al ambelor tulpini a arătat o scădere pe parcursul experimentelor, după cum sa raportat în Tabelul 1 și în Figurile 1, 2 și 3. Cele două tulpini MRSA au prezentat o variație diferită a rezistenței acide la o valoare dată a pH-ului. În detaliu, în controale și în ambele matrice, variația rezistenței la acid a ST398 a corespuns unui coeficient de variație sub factorul 10, în timp ce pentru ST1 a fost peste factorul 10 2 .
| T0 | 6 | 7.7 | 0,1 | 7.4 | 0,4 | 7.9 | 0,4 | 7.9 | 0,3 | 7.5 | 0,4 | 7.5 | 0,3 |
| T1 | 5 | 7.5 | 0,8 | 7.4 | 0,1 | 7.7 | 0,5 | 7.5 | 0,3 | 7.2 | 0,9 | 6.3 | 0,3 |
| T2 | 4 | 7.6 | 0,2 | 6.1 | 0,3 | 7.8 | 0,3 | 7.4 | 0,2 | 7.2 | 0,4 | 6.7 | 0,4 |
| T3 | 3 | 7.6 | 0,1 | 0,0 | 0,0 | 7.8 | 0,2 | 7.6 | 0,1 | 6.9 | 0,2 | 0,0 | 0,0 |
| T4 | 2 | 7.5 | 0,3 | 0,0 | 0,0 | 7.6 | 0,2 | 0,0 | 0,0 | 6.5 | 0,0 | 0,0 | 0,0 |
- R = interval (de variație) între cele două repetări ale fiecărui test.
Pragul de supraviețuire al ambelor tulpini a fost mai mare în ricotta brânză decât în hamburger (Figurile 1, 2 și 3). Numărurile de log 7,5 și 7,6 cfu/g de ST398 au fost încă obținute la T4 (pH 2) la controale și la ricotta brânză, respectiv. Cea mai semnificativă scădere pentru ST398 a fost înregistrată la T3 (pH 3) în experimentul de hamburger, în care am înregistrat un log cfu/g mai mic decât concentrația sa la pH-ul inițial (T0; pH 6,0) (Tabelul 1). În mod similar, tulpina ST1 din ricotta brânza a fost detectabilă cu ușoare scăderi în cursul experimentului până la T3 (pH 3), când s-a obținut încă un număr de 7,6 cfu/g. După aceea, nu a mai fost detectabil (T4; pH 2,0). În schimb, în hamburgeri a existat o scădere semnificativă, cu un număr de log 6,5 cfu/g, la T2 (pH 4), după care nu a mai fost detectabil (Tabelul 1).
3.2 Numărul total de bacterii
numărul total de bacterii a arătat o scădere pe parcursul experimentului. În detaliu, la T0 numărul total de bacterii, în ricotta brânză și experimentul de hamburger, au variat între jurnalul 7,4 și respectiv 7,0 cfu/g. La T2 (pH 4), numărul total de bacterii, în ambele matrice, a păstrat aceleași valori cu o creștere ușoară pentru ricotta brânză (log 7,6 cfu/g) și o ușoară scădere pentru hamburger (log 6,9 cfu/g). La T4 (pH 2), numărul total de bacterii nu a mai fost detectabil în niciuna dintre matrice.
4. DISCUTIE
Staphylococcus aureus și varianta sa rezistentă la meticilină (SARM) sunt microorganisme care au un impact mare atât asupra medicinei umane, cât și pe cea veterinară (OMS, 2014). Adaptabilitatea stafilococică marcată și coevolutia sa cu gazda (gazdele) îi permit să aibă succes ca agent patogen oportunist și să fie rezistent la medii în schimbare (Clements & Foster, 1998). S. aureus este, de asemenea, unul dintre principalii agenți patogeni de origine alimentară, reprezentând principala sursă de intoxicație alimentară (Fetsch & Johler, 2018; Le Loir, Baron și Gautier, 2003). În plus, MRSA a fost identificat ca fiind o cauză importantă de enterocolită în special la pacienții spitalizați și la cei care au scăzut producția de acid gastric (Pressly și colab., 2016). Detectarea MRSA într-o varietate de alimente de origine animală, ca o consecință a contaminării cu animale și/sau umane (Normanno și colab., 2007), a lansat o dezbatere științifică cu privire la rolul său în cauzarea infecțiilor prin intermediul consumul de alimente, dar supraviețuirea MRSA în condițiile acide ale stomacului uman nu a fost încă investigată.
Presupunând că bariera bactericidă gastrică este în principal dependentă de acid (Drasar, Shiner și McLeod, 1969; Hornick și colab., 1971; Peterson, Mackowiak, Barnett, Marling-Cason și Haley, 1989) deoarece pH-ul scăzut este capabil să controlează populația bacteriană din mediul gastric (Smith, 2003), am investigat capacitatea MRSA de a depăși bariera gastrică umană prin imitarea condițiilor acide ale stomacului.
Din câte știm, acesta este primul studiu care investighează comportamentul tulpinilor MRSA în condițiile acide ale stomacului uman. Deși am detectat diferențe între rezistența acidă a celor două tulpini MRSA utilizate în experimentele noastre, rezultatele noastre demonstrează că anumite tulpini de MRSA au o capacitate (prob) puternică de a supraviețui în condiții de stres acid. În consecință, ar putea trece bariera gastrică și pot ajunge la intestin unde ar putea provoca o infecție activă (Bergevin și colab., 2017; Pressly și colab., 2016; Watanabe și colab., 2001).
În concluzie, rezultatele noastre oferă noi cunoștințe cu privire la soarta MRSA în condițiile acide ale unui stomac uman in vitro și pot contribui la o mai bună definire a rolului MRSA în dezbaterea siguranței alimentare.
CONFLICTUL DE INTERES
Autorii nu au niciun conflict de interese de declarat.
NOTĂ FINALĂ
Publicat cu o contribuție din 5 x 1000 de fonduri IRPEF în favoarea Universității din Foggia, în memoria lui Gianluca Montel.