A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Vladimir Vinokur, Sarah Weksler-Zangen

pierderea

Departamentul de Biochimie și Biologie Moleculară, Institutul de Cercetări Medicale Israel-Canada, Universitatea Ebraică din Ierusalim, Ierusalim, Israel, Departamentul de Otorinolaringologie-Chirurgie cap și gât, Hadassah-Spitalul Universitar Ebraic, Ierusalim, Israel

A contribuit în mod egal la această lucrare cu: Vladimir Vinokur, Sarah Weksler-Zangen

Afiliere Unitatea Diabet, Departamentul de Medicină Internă, Centrul Medical Hadassah-Hebrew University, Ierusalim, Israel

Departamentul de Afiliere pentru Biochimie și Biologie Moleculară, Institutul de Cercetări Medicale Israel-Canada, Universitatea Ebraică din Ierusalim, Ierusalim, Israel

Autori ‡ Acești autori au contribuit, de asemenea, în mod egal la această lucrare.

Departamentul de afiliere pentru otorinolaringologie-chirurgie cap și gât, Hadassah-Hebrew University Hospital, Ierusalim, Israel

Autori ‡ Acești autori au contribuit, de asemenea, în mod egal la această lucrare.

Departamentul de Afiliere pentru Biochimie și Biologie Moleculară, Institutul de Cercetări Medicale Israel-Canada, Universitatea Ebraică din Ierusalim, Ierusalim, Israel

  • Vladimir Vinokur,
  • Sarah Weksler-Zangen,
  • Eduard Berenshtein,
  • Ron Eliashar,
  • Mordechai Chevion

Cifre

Abstract

Citare: Vinokur V, Weksler-Zangen S, Berenshtein E, Eliashar R, Chevion M (2016) Pierderea beneficiului miocardic după condiționarea ischemică este asociată cu disregularea homeostaziei fierului în diabetul indus de dietă. PLoS ONE 11 (7): e0159908. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0159908

Editor: Fanis Missirlis, CINVESTAV-IPN, MEXICO

Primit: 21 decembrie 2015; Admis: 11 iulie 2016; Publicat: 26 iulie 2016

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Această cercetare a fost susținută de granturi de cercetare (acordate către MC) de la Dr. Avraham Moshe și Pepka Bergman Memorial Fund, de către Fundația germano-israeliană pentru cercetare științifică și dezvoltare (GIF 1061-59.2/2008) și de către Israel Science Foundation (ISF 489/12) și (către SW-Z) de la minister de știință și cultură a statului Saxonia Inferioară, Hanovra, Germania. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Afecțiunile cardiace constituie principalele cauze ale morbidității și mortalității în lumea occidentală [1,2]. Eforturile sunt continuu investite în încercări pentru a proteja inima bolnavă. Murry și colab. și publicațiile ulterioare privind pacienții cu inimă și modelele animale de ischemie și reperfuzie cardiacă au demonstrat că precondiționarea ischemică (IPC) - supunerea inimii la o serie de scurte perioade de ischemie separate de perioade scurte de perfuzie - a îmbunătățit semnificativ recuperarea funcțională post-ischemică și inima capacitatea de a rezista unei insulte ulterioare, mai intense. Într-adevăr, procedura IPC a fost utilizată clinic în timpul și după operația cardiacă, angioplastia coronariană transluminală percutană (PTCA) și transplantul de inimă [3]. Angina pectorală (durere toracică), un analog clinic al IPC experimental, dacă a fost prezentată imediat înainte de infarctul miocardic acut (IMA) s-a dovedit a fi protectoare pentru inima umană [3,4]. Cu toate acestea, efectul benefic al IPC asupra inimilor diabetice este încă controversat [5,6].

În acest studiu ne-am concentrat pe diabetul de tip 2 indus de dietă. Modelul de șobolan Cohen-Diabetic, utilizat în acest studiu, cuprinde două tulpini contrastante derivate genetic. Tulpina sensibilă a CD-urilor care dezvoltă hiperglicemie atunci când este hrănită cu o dietă diabetogenă cu conținut scăzut de cupru-zaharoză (HSD), dar menține normoglicemia pe o dietă obișnuită (RD). Tulpina rezistentă la CDr nu dezvoltă hiperglicemie chiar și atunci când este hrănită cu HSD [11]. Șobolanii-CD-uri hiperglicemici prezintă niveluri normale de glucoză în repaus alimentar fără rezistență la insulină, dar celulele β pancreatice prezintă o capacitate semnificativ redusă de a secreta insulină ca răspuns la glucoză (GSIS) [11,12]. Asemănător modelului diabetic de tip 1 indus de STZ, toți șobolanii CD prezintă fenotip de diabet de tip 2, fără grupuri intermediare caracterizate prin niveluri mai scăzute de glucoză din sânge.

O asociere strânsă între disponibilitatea cuprului și homeostazia fierului a fost bine stabilită [13]. O serie de proteine, cum ar fi hephaestin și ceruloplasmin, sunt implicate în absorbția celulară și secreția de fier. Aceste proteine ​​conțin ioni esențiali de cupru în centrul lor activ sau în grupul lor protetic. Astfel, o dietă cu deficit de cupru se poate dovedi dăunătoare menținerii homeostaziei adecvate a fierului, la nivelurile celulare și ale organismului întreg, ducând la o varietate de tulburări [13].

Materiale și metode

Animale

CD-urile masculine vechi de opt săptămâni și șobolanii CDr hrăniți cu RD au fost trecuți la HSD pentru o perioadă de 30 de zile. Controalele au fost menținute pe RD pentru aceeași perioadă de timp. Șobolanii au fost împărțiți în 4 subgrupuri: CD-uri-RD, CDr-RD, CD-uri-HSD și CDr-HSD; doar șobolanii CD-HSD au devenit hiperglicemici [11]. Greutatea corporală medie a fost următoarea: CD-RD - 263 ± 18g; CD-uri HSD - 262 ± 12g; CDr-RD - 260 ± 7g; CDr-HSD - 259 ± 12g. Valorile sunt afișate ca medie ± eroare standard. Hiperglicemia a fost confirmată la șobolanii CD după 30 de zile pe HSD printr-un test de glicemie postprandial de 2 ore> 200 mg/dl [12,14]. Valorile glicemiei celorlalte grupuri au fost de 112 ± 4 mg/dl în grupul CDr-HSD, 94 ± 6 în CD-RD și 105 ± 4 în CDr-RD (valorile sunt prezentate ca medie ± eroare standard ). Șobolanii au fost crescuți și întreținuți în unitatea de animale de la Școala de Medicină a Universității Ebraice, Ierusalim, Israel, în condiții standard (12 h lumină/12 h întuneric) și au fost hrăniți cu o dietă adecvată și apă distilată ad libitum.

Protocoalele experimentale au fost aprobate de Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor din cadrul Universității Ebraice din Ierusalim (MD-13-13922-3).

RD a constat dintr-un amestec de grâu integral măcinat, lucernă măcinată, tărâțe, lapte praf degresat și săruri, rezultând 21% proteine, 60% carbohidrați, 5% grăsimi și 0,45% conținut de NaCl (Koffolk, Israel). HSD preparat la comandă conținea 72% zaharoză; 18% cazeină fără vitamine; 5% amestec de sare nr. 2I XIII (MP Biomedicals, SUA); 4,5% unt; 0,5% ulei de porumb, vitamine și conținut scăzut de cupru (0,9 ppm) [11,15].

Nivelul glicemiei

La vârsta de 12 săptămâni, nivelul glicemiei (BG) a fost determinat la 2h postprandial. Șobolanii CD-RD, CDr-RD și CDr-HSD au menținut BG în intervalul normal (200 mg/dl).

Perfuzie cardiacă și parametri hemodinamici.

Înainte de operația terminală a exciziei cardiace, șobolanii au fost injectați cu heparină de sodiu (500 unități/kg i.p.), urmată după 30 de minute de un amestec de 80 mg/kg ketamină și 5 mg/kg xilazină 100 μl i.p. La toracotomia bilaterală, inimile cu un segment de aortă ascendentă au fost îndepărtate rapid și plasate timp de 5 minute. în soluție salină heparinizată rece ca gheața. Greutatea medie a inimii a fost de 1,1 ± 0,1 g. Nu au fost detectate diferențe între grupuri.

Perfuzia inimii de șobolan izolată a fost efectuată pe aparatul Langendorff așa cum s-a descris anterior [8,9], folosind un balon # 3 (Harvard Apparatus, MA, SUA). Tamponul de perfuzie a fost o soluție „fără sânge” de tampon Krebs-Henseleit (KH) modificat. Conținea 118 mM NaCI, 5,8 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 25 mM NaHCO3 și 11,1 mM glucoză. Toate tampoanele de perfuzie au fost preparate în ziua experimentului în apă dublă distilată și filtrate înainte de utilizare. Toate vasele au fost spălate în prealabil cu EDTA (0,1 M) înainte de utilizare. Temperatura din sistem a fost menținută constant la 37 ° C. Frecvența cardiacă (HR), presiunea diastolică finală (EDP), presiunea dezvoltată (DP) și derivații săi (+ dp/dt și -dp/dt) au fost înregistrate și evaluate. La începutul experimentului, valoarea EDP a fost setată manual la 0 mm Hg. Toate datele primare au fost procesate utilizând o versiune personalizată a software-ului LabView. Indicele de lucru (WI = Heart Rate x DP) a fost utilizat ca o măsură a contractilității cardiace. Gradul de cardioprotecție a fost exprimat prin raportul procentual de două valori: WI la minutul 120 (finalizarea fazei de reperfuzie) și WI la minutul 10 (ultimul minut al fazei de stabilizare). La sfârșitul experimentului, inima a fost înghețată rapid în azot lichid și depozitată la -80 ° C pentru analize suplimentare.

Protocoale experimentale

Au fost utilizate cele trei protocoale experimentale de bază utilizate adesea în laboratorul nostru [8] (Fig. 1A): (i) IPC urmat de I/R (bara superioară); (ii) I/R (bara din mijloc); și (iii) perfuzie continuă (bara inferioară). Pentru fiecare punct de timp, au fost testate 7-9 inimi.

Trei protocoale experimentale de bază (A) și recuperarea post-ischemică a WI (B și C). (A) (i) IPC urmat de I/R (bara superioară); ii) I/R (bara de mijloc); și (iii) perfuzie continuă (bara inferioară). (B și C) Recuperare post-ischemică a WI pentru inimi de la șobolani Cohen rezistenți la diabet (CDr) (panoul 1B) și șobolani sensibili la diabet Cohen (CD) (panou 1C), supuși I/R fără și cu IPC prealabil . Animalele au fost hrănite fie cu diete bogate în zaharoză/cu conținut scăzut de cupru (HSD), fie cu diete obișnuite (RD). WI a fost calculat ca produs al presiunii dezvoltate x ritmul cardiac (DP * HR). Gradul de cardioprotecție a fost exprimat ca raport procentual (%) a două valori: WI la minutul 120 (finalizarea fazei de reperfuzie) și WI la minutul 10 (ultimul minut al fazei de stabilizare). Sunt afișate valorile medii ± SEM; *—P # —P ‡ —P Fig 2. Nivelurile de feritină în inimile șobolanilor Cohen.

Nivelurile de feritină din inimă de la șobolanii Cohen rezistenți la diabet (CDr) (panoul A) și cei sensibili la diabetul Cohen (CD) (panoul B), hrăniți fie cu dietă bogată în zaharoză (HSD), fie cu dietă obișnuită (RD) și supuși IPC + Protocol I/R. În aceste experimente, inimile au fost stabilizate (10 min), urmate de procedura IPC (15 min), ischemie (35 min) și reperfuzie (60 min). Concentrația de feritină a fost măsurată utilizând ELISA. Sunt afișate mijloacele ± SEM. *—Denote p Tabelul 1. Parametrii hemodinamici ai inimii șobolanilor înainte și după I/R cu și fără IPC anterioară.

Concentrațiile de feritină

Inimile din oricare dintre cele trei grupuri normoglicemice (Fig 2), când au fost supuse la IPC + I/R, au prezentat tendințe analoage: o creștere marcată a concentrației de feritină în timpul IPC, o creștere mai ușoară în timpul fazei ulterioare de ischemie prelungită și degradarea rapidă a feritinei și reveniți la nivelul său bazal în timpul următoarei reperfuzii. În inimile hiperglicemiante, nivelul feritinei bazale a fost semnificativ mai mare (0,32 ± 0,02 μg/mg) decât nivelul inițial al celorlalte trei grupuri cardiace (0,17 ± 0,02 μg/mg; p Fig 3. Saturația feritinei cu Fe.

Saturația feritinei cu Fe (NFe) în inimile șobolanilor sensibili la diabet și sensibili la diabet Cohen hrăniți cu diete bogate în zaharoză sau obișnuite, supuși IPC și urmați de I/R.

Experimentele au fost realizate folosind modelul inimii de șobolan izolate (Langendorff). De-a lungul protocoalelor nu s-au produs importuri și/și nici o pierdere semnificativă de fier din inimă [9]. Se așteaptă ca modificările NFe, de-a lungul protocolului, să fie legate invers de modificările nivelurilor de feritină, așa cum s-a demonstrat pentru inimile non-diabetice [8].

În inimile CD-HSD, valorile NFe au fost semnificativ dincolo de intervalul normal (atingând

6600 atomi/moleculă la momentul inițial), care este în concordanță cu supraîncărcarea fierului asociată cu diabetul zaharat [23].

nivelurile de ARNm ale subunităților de feritină

Nivelurile de ARNm ale feritinei L-subunitate, la momentul inițial, au fost similare între ele în toate cele patru grupuri. De asemenea, aceste valori ale ARNm nu s-au modificat de-a lungul întregului protocol IPC + I/R (datele nu sunt prezentate). Nivelurile de ARNm ale subunităților feritinei H au fost de 1,5 ori mai mari în inimile CD-urilor, în comparație cu inimile CDr (Fig. 4). Pentru inimile CDr-RD, CDr-HSD și CDs-RD, nivelurile de ARNm ale subunității feritinei H au rămas constante de-a lungul întregului protocol IPC + I/R. Spre deosebire de acestea, în inimile cu CD-uri HSD diabetice, nivelurile de ARNm ale subunității H au scăzut de 1,5 ori, în timpul fazei IPC și au scăzut în continuare în timpul ischemiei ulterioare; nivelurile au fost readuse la valorile de bază în timpul reperfuziei.