Afilieri Laboratório de Biotecnologia, Centro de Citricultura Sylvio Moreira, Instituto Agronômico de Campinas, Cordeirópolis, São Paulo, Brazilia, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, São Paulo, Brazilia

dublu

Afiliere Laboratório de Biotecnologia, Centro de Citricultura Sylvio Moreira, Instituto Agronômico de Campinas, Cordeirópolis, São Paulo, Brazilia

Afiliere Escola Superior de Agricultură Luiz de Queiróz, Universidade de São Paulo, Piracicaba, São Paulo, Brazilia

Departamentul de patologie a plantelor de afiliere, Universitatea din California Davis, Davis, California, Statele Unite ale Americii

Afiliere Laboratório de Biotecnologia, Centro de Citricultura Sylvio Moreira, Instituto Agronômico de Campinas, Cordeirópolis, São Paulo, Brazilia

  • Diogo Manzano Galdeano,
  • Michèle Claire Breton,
  • João Roberto Spotti Lopes,
  • Bryce W. Falk,
  • Marcos Antonio Machado

Cifre

Abstract

Citare: Galdeano DM, Breton MC, Lopes JRS, Falk BW, Machado MA (2017) Livrarea orală a ARN-urilor dublu catenare induce mortalitatea la nimfe și adulți ai psilidei citrice asiatice, Diaphorina citri. PLOS ONE 12 (3): e0171847. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0171847

Editor: Randall P. Niedz, Departamentul Agriculturii din Statele Unite, STATELE UNITE

Primit: 1 august 2016; Admis: 26 ianuarie 2017; Publicat: 10 martie 2017

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante se află în hârtie și în fișierele sale de informații de suport.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de Fundația Amparo din Pesquisa do São Paulo (2013/02138-0, 2014/03925-8 și 2008/57909-2) și CNPq (573848/08-4).

Interese concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Psilida asiatică a citricelor (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), este o insectă hrănitoare cu floem și cel mai important dăunător din punct de vedere economic al citricelor, în principal pentru că este vectorul pentru agenții cauzali ai huanglongbing (HLB), Candidatus Liberibacter asiaticus și Candidatus Liberibacter americanus [1,2]. HLB apare în toate regiunile de citrice din Asia, Africa și America și este cea mai importantă boală care afectează citricele la nivel mondial, având ca rezultat declinul copacilor, calitatea redusă a fructelor și moartea copacilor [3-5]. Atât adulții ACP, cât și nimfele pot transmite bacteriile, iar atunci când este dobândită de nimfe, bacteriile pot fi reținute și transmise după apariția adulților, sugerând că agentul patogen se înmulțește și circulă în ACP [6]. Mai mult, bacteriile pot fi transmise la rate scăzute de la femelele infectate transovarial la descendenții lor [7] și de la masculii infectați la femelele neinfectate în timpul împerecherii [8].

Pentru a controla populațiile de D. citri, cultivatorii de citrice utilizează mai multe insecticide diferite [9]. Cu toate acestea, utilizarea nediscriminată și continuă a acestor insecticide poate duce la rezistența dăunătorilor, ceea ce duce invariabil la creșterea costurilor de producție [10]. O provocare principală pentru cercetători a fost dezvoltarea de strategii eficiente pentru controlul D. citri cu impact redus asupra mediului, cum ar fi utilizarea ectoparasitoidului Tamarixia radiata (Hymenoptera: Eulophidae) [11] ca prădător natural [12], ciuperci entomopatogene [13] ] și recent interferența ARN (ARNi) [14-16].

ARNi este un instrument puternic pentru studierea genomicii funcționale la eucariote, inclusiv la insecte [17]. Descoperirea ARN-ului cu dublă catenă (dsRNA) mediate de tăcere specifică genei în nematodul Caenorhabditis elegans [18] a permis ca ARN-urile mediate de dsARN să fie utilizate pentru diferite insecte de cultură pentru a reduce la tăcere anumite gene [19].

Primul pas pentru succesul ARN-ului la insecte este acela de a identifica o metodă convenabilă și fiabilă pentru administrarea ARNd-ului către gena țintă. Microinjecția, înmuierea și hrănirea sunt de obicei adoptate pentru a furniza ARNd-ul către insecte [20]. Au fost raportate efecte de eliminare a ARNm țintă de succes prin hrănirea artificială a ARNds la insectele dăunătoare ale culturilor, inclusiv psyllidul de cartofi/roșii (Bactericera cockerelli), muștele alb (Bemisia tabaci), viermele rădăcinii de porumb occidental (Diabrotica virgifera virgifera), afidul de mazăre (Acyrthosiphon pisum), viermele de bumbac (Helicoverpa armigera), musca orientală a fructelor (Bactrocera dorsalis), viermele de sfeclă (Spodoptera exigua) și pădărul brun (Nilaparvata lugens) [21-29]. Cu toate acestea, este dificil să se utilizeze hrănirea artificială a ARNd-ului în timpul etapelor juvenile ale unor insecte; astfel, a fost dezvoltat un sistem eficient pentru a reduce la tăcere genele nimfelor cu muște albe prin hrănirea dsRNA mediată de frunze [30]. Mai mult, unele studii au demonstrat că ineficiența administrării orale de ARNi în rândul speciilor de insecte este atribuibilă degradării rapide a ARNd-ului, care este probabil indusă de enzimele nucleaze în lumenul intestinal [31,32] sau în salivă [33], astfel, pentru aceste specii de insecte, metoda de livrare mai bună a ARNd-ului este injectarea de ADNr gol în cavitatea corpului [34].

În studiul de față, am explorat efectele ARNi la adultul și nimfa D. citri care au fost hrănite cu ADNr specifice genei care vizează catepsina D, chitina sintază și inhibitorul apoptozei printr-o dietă artificială și prin frunze de plante. Am arătat că ambele metode de eliberare a ARNd sunt eficiente în reducerea genelor ACP, reducând rata mortalității în timp și reglând în jos genele țintă.

Materiale și metode

Insecte și plante

ACP-urile au fost crescute în Citrus macrophylla în cuști de plasă menținute la 25 ± 2 ° C sub o fotoperioadă de 14:10 h (lumină: întuneric) și 60 până la 70% umiditate relativă (HR) la Facilitatea de Cercetare Conținută (CRF) a Universității din California, Davis (CA, SUA; http://crf.ucdavis.edu/). ACP-urile generale adulte și femelele împerecheate au fost utilizate pentru testele de hrănire a dietei artificiale și respectiv în pliantele Murraya paniculata (L) Jack (Rutaceae).

Izolarea ARN și sinteza ADNc

ARN-urile totale au fost izolate dintr-un grup de zece ACP vii folosind ZR Tissue and Insect Microprep ™ (Zymo Research, Irvine, CA, SUA, catalog nr. D6015), iar ADN-ul genomic a fost îndepărtat din probe cu un set DNAse I (Zymo Research, Irvine, CA, SUA, catalog nr. E1010) conform protocolului producătorului. Concentrația și puritatea au fost determinate folosind un spectrofotometru NanoDrop ND 8000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, SUA). Sinteza ADNc a fost efectuată utilizând iScript ™ Reverse Transcription Supermix (Bio-Rad ®, Hercules, CA, SUA, catalog nr. 170–8841) conform protocolului producătorului.

Identificare, exemplu de proiectare și amplificare a genelor țintă

Pentru a identifica catepsina D, chitina sintază și inhibitorul genelor apoptozei ACP, adnotarea secvențelor transcriptomului D. citri a fost efectuată prin screening-ul băncii de date Psyllid.org (http://psyllid.org/download) pe baza secvențelor de aminoacizi. de insecte depuse în NCBI (Acyrthosiphon pisum, Aedes aegypti, Anopheles gambiae, Apis florea, Apis mellifera, Bombus impatiens, Bombus terrestris, Drosophila melanogaster, Drosophila pseudoobscura) folosind BlastX. Amorsele și sondele au fost proiectate folosind instrumentul PrimerBlast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) (Tabelul 1). Produsul PCR corespunzător secvenței GFP a fost amplificat din plasmida pJL24. PCR-urile au fost efectuate folosind proceduri standard (Sambrook, 2012) cu GoTaq ® ADN polimerază (Promega Corporation, Madison, WI). Fragmentele au fost analizate pe 1% geluri de agaroză conținând 1% ADN sigur SYBR ® (Invitrogen ®). Secvențele de amplicon au fost confirmate prin secvențierea.

Preparat ARN bicatenar

DsARN-urile au fost sintetizate in vitro cu kitul MEGAscript RNAi (Ambion, nr. Catalog AM1626) folosind gene șabloane și produse PCR GFP ca șabloane. Secvența T7 (5 ’TAATACGACTCACTATAGGGAGA 3’) a fost plasată în fața amorsilor înainte și inversi care au fost folosiți pentru amplificarea PCR a șablonului pentru sinteza dsARN. PCR de catepsină D, chitină sintază, inhibitor al apoptozei și regiuni de codificare GFP a fost efectuată utilizând GoTaq ® Colorless Flexi Buffer 5X (Promega), 25 mM MgCl2, 10 mM dNTPs, 10 μM primer înainte promotor T7, 10 μM primer invers plus T7 promotor, 5 U/μL GoTaq ® ADN polimerază și 1 μL ADNc. Produsele PCR au fost purificate conform kitului de purificare QIAquick PCR (Qiagen, CA, SUA).

Transcrierea in vitro a fost efectuată folosind ADN purificat (1 μg), tampon de reacție 10X, ribonucleotidă (ATP, GTP, CTP, UTP) și enzima T7. Reacția a fost incubată la 37 ° C peste noapte. Șablonul de ADN a fost îndepărtat folosind un kit fără ADN TURBO (Ambion, TX, SUA). ARNs-urile au fost precipitate prin adăugarea a 30 μL soluție de precipitare cu clorură de litiu (7,5 M clorură de litiu, 50 mM EDTA) și 30 μL apă fără nuclează. Probele au fost incubate timp de 1 oră la -20 ° C și centrifugate la 4 ° C timp de 15 minute la 16.000 g. Supernatantul a fost îndepărtat și peletele au fost spălate o dată cu 1 ml de etanol 70%. Etanolul a fost îndepărtat și ARNds a fost eluat în 20 μL de apă fără nuclează. Calitatea dsARN a fost monitorizată folosind electroforeza pe gel de agaroză, iar concentrația a fost determinată utilizând NanoDrop.

Bioanalize pentru studiile RNAi pe bază de hrănire folosind diete artificiale

ACP-urilor generale pentru adulți li s-a permis să se hrănească cu o soluție de dietă artificială formată din 15% (greutate: v) zaharoză și coloranți alimentari (0,1% verzi și 0,4% galbeni) (McCORMICK & CO). O porțiune din dieta artificială (100 μL) a fost pipetată pe parafilm și un alt strat întins deasupra flaconului din plastic transparent (25 mm X 45 mm) pentru a forma un plic și pentru a se asigura că dieta lichidă a fost distribuită uniform. Testele de alimentare au fost efectuate la temperatura camerei într-o fotoperioadă de 14:10 h (lumină: întuneric) și 60-70% RH, iar flacoanele din plastic au fost plasate la 1,20 m de sursa de lumină. Pentru evaluările mortalității, catepsina D, chitina sintază și inhibitorul concentrațiilor apoptozei dsARN (200, 500, 1000 ng.μL -1) au fost standardizate și diluate în dieta artificială și utilizate pentru testele de hrănire. Fiecare replică a constat din 30 de indivizi în 3 flacoane din plastic (10 indivizi în fiecare flacon) și au fost analizate trei replici. ARNs GFP la aceleași concentrații în soluții de hrănire a zaharozei de 15% au fost utilizate ca martori pentru fiecare experiment. După ce ACP-urile adulte au fost hrănite timp de 120 de ore, ARN-urile totale au fost izolate dintr-un grup de trei ACP-uri adulte și utilizate pentru sinteza ADNc așa cum este descris mai sus.

Pentru a testa stabilitatea dsARN-urilor în soluția de dietă artificială, s-au colectat 50 μL din fiecare soluție după a 5-a zi de hrănire. Soluțiile de dietă artificială au fost diluate în apă distilată (1/10), iar ARNds au fost observate în 1% geluri de agaroză.

Bio-teste pentru studii RNAi pe bază de hrănire folosind pliante Murraya paniculata

Stabilitatea dsARN-urilor din tuburi și frunze a fost evaluată în ultima zi a testului. dsARN-urile din tuburi au fost colectate în a 11-a zi a testului de hrănire descris mai sus. Pentru a detecta dsRNA-urile din frunze, a fost colectată o bucată de frunză (0,05 g) și înghețată imediat în azot lichid. ARN-ul total a fost izolat din țesuturile frunzelor. Amorsele pentru sinteza ADNr împreună cu probele de ARN au fost încălzite în apă fiartă timp de 5 minute și stinse pe gheață. Apoi, ARN a fost transcris invers și ADNc a fost utilizat pentru RT-PCR [30]. Atât soluția de dsRNA din tuburi, cât și produsele PCR ale dsRNA din țesuturile frunzelor plantelor au fost analizate prin electroforeză în geluri de agaroză 1% pentru a examina dimensiunea și integritatea dsARN-urilor.

Reacție în lanț cantitativă cu transcripție inversă a polimerazei (qRT-PCR)

Expresia genică relativă a fost evaluată folosind metoda 2 -ΔΔCT. Valoarea medie și valoarea erorii standard (valoarea SE) a valorii 2 -ΔΔCT în grupurile de tratament și control au fost calculate separat, iar analizele statistice au fost efectuate pentru a compara aceste două grupuri. Reacțiile au fost configurate în plăci de PCR Microseal cu 96 de godeuri (Bio-Rad ®, Hercules, CA, SUA) în triplicat.

analize statistice

Datele experimentale din testele de hrănire dsRNA și expresia de eliminare a ARNm țintă au fost evaluate folosind ANOVA unidirecțional cu testul lui Tukey.

Rezultate

Mortalitatea ACP indusă de ARNds pe dieta artificială

Ratele mortalității prin hrănirea cu 15% a dietelor artificiale de zaharoză care conțin ARNs de GFP, catepsină D, chitină sintază și inhibitor al apoptozei la (A) 200 ng.μL -1, (B) 500 ng.μL -1 și (C) 1000 ng. μL -1 în timp. Diferite litere indică diferențe semnificative statistic în ratele mortalității psihidelor între diferite tratamente în aceleași momente de timp (P -1 a catepsinei D, chitina sintază și inhibitor al apoptozei și al ARNs GFP după 120 de ore de testare a hrănirii. Diferențele statistice sunt, de asemenea, prezentate de diferite litere între diferite concentrații pentru același dsRNA în același punct de timp CD: dpsARN de catepsină D; CS: dsARN de chitină sintază; IA: inhibitor al dsARN de apoptoză.

Mortalitatea D. citri a prezentat o corelație pozitivă cu concentrațiile genelor țintă și a tratamentelor GFP dsRNA (Fig. 1D). Toate dsRNA-urile testate și GFP au cauzat o mortalitate mai mare la 1000 ng.μL -1 în comparație cu concentrații mai mici pentru fiecare dsRNA testat.

După cinci zile, dsRNA-urile au fost detectate în diete artificiale de zaharoză 15%, demonstrând stabilitatea acestor molecule și indicând faptul că hrănirea dsRNA-urilor prin diete artificiale este o abordare bună pentru selectarea țintelor RNAi pentru D. citri (S2 Fig).

Ratele mortalității nimfelor induse de captarea ARNdd prin frunzele M. paniculata

O metodă a fost dezvoltată pentru a reduce la tăcere genele ACP prin hrănirea ARNs prin pliante de plante. Asimilarea dsARN-ului de către prospectul M. paniculata și stabilitatea acestuia atât în ​​microtuburi, cât și în țesuturile plantei au fost evaluate în ultima zi a testului de hrănire. Rezultatele au arătat că toate dsRNA-urile, catepsina D, chitina sintază și inhibitorul apoptozei și GFP au fost stabile în tuburi (Fig 2A) și în frunze în timpul experimentului de 11 zile (Fig 2B). Prin urmare, această abordare a eliberării dsARN-urilor prin frunze tăiate a fost ulterior utilizată pentru a viza knockdown-ul ARNm pentru a reduce la tăcere genele din D. citri.

Stabilitatea catepsinei D, a chitinei sintazei, a inhibitorului apoptozei și a ADNr-urilor GFP din soluțiile în care foliile M. paniculata au fost înmuiate (A) și în frunze (B) în a 11-a zi a testului de hrănire au fost analizate prin electroforeză pe gel de agaroză. CD: ADNc de catepsină D; CS: dsARN de chitină sintază; IA: inhibitor al apoptozei dsARN.

Rata de supraviețuire a nimfelor D. citri prin hrănirea dsARN-urilor de GFP, catepsină D, chitină sintază și inhibitor al apoptozei prin frunzele M. paniculata în timp. Diferite litere indică diferențe semnificative din punct de vedere statistic în ratele mortalității psihidelor între diferite tratamente în același timp (P -1 dsRNA și ARN-uri totale au fost extrase din ACP vii. După expunerea la dpsARN de catepsină D timp de cinci zile, nivelul de expresie relativ al țintei gena din D. citri a fost redusă la 46, 52 și 64% pe 200, 500 și 1000 ng. μL -1 dsRNA, respectiv (Fig. 4A). Când ACP-urile au fost alimentate continuu cu dsRNA de chitină sintază la 200, 500 și 1000 ng μL -1, reduceri ale ARNm de 76, 66 și 48% au fost observate la cinci zile după hrănire, respectiv (Fig. 4B). Mai mult, nivelurile de ARNm ale inhibitorului apoptozei de D. citri au fost reduse la 50, 46 și 36 % pe 200, 500 și 1000 ng.μL -1 dsRNA, respectiv (Fig. 4C).

ARNd-urile au fost adăugate la dietele artificiale la concentrații de 200, 500 și 1000 ng.μL -1, iar ARN-urile totale au fost izolate din psilidele vii după 120 h de hrănire. D. citri alimentat cu ADNr cu GFP a servit drept controale pentru fiecare experiment. (A) Acumularea de ARNm de catepsină D în psilide întregi hrănite cu dsRNA de catepsină D la 200, 500 și 1000 ng.μL -1. (B) Acumularea de mARN-uri de chitină sintază în psilide întregi alimentate cu dsARN de chitină sintază la 200, 500 și 1000 ng.μL -1. (A) Acumularea inhibitorului mRNA apoptozei în psihile întregi hrănite inhibitor al dsRNA apoptozei la 200, 500 și 1000 ng.μL -1. Diferențe semnificative în expresia relativă au fost evaluate între dsARN-urile testate și dsARN-ul GFP la aceleași concentrații. Un singur asterisc indică P Fig 5. Eliminarea mARN-urilor psilidului endogen de către dsRNA hrănite cu frunze de M. paniculata după 11 zile.

În concluzie, dezvoltarea tehnicilor fiabile de ARNi pentru D. citri oferă un punct de plecare pentru evaluarea funcției genetice și este o modalitate eficientă de a testa și valida posibile situri țintă care pot fi exploatate ca noi strategii de control [14-16]. Rezultatele noastre demonstrează că achiziția orală a ARNd-ului prin diete artificiale și frunze de plante detașate provoacă efecte RNAi în diferite etape de dezvoltare ale D. citri. Această constatare este importantă, deoarece se preferă administrarea orală de dsARN la insecte, cum ar fi combaterea dăunătorilor, deși la unele specii de insecte dsARN-ul este degradat rapid în lumenul intestinal prin acțiunea dsARN-urilor [31]. Astfel, achiziția orală de către D. citri susține posibilitatea utilizării potențiale a strategiilor bazate pe ARNi pentru controlul acestei psilide foarte importante.

Informatii justificative

S1 FIG. Stabilitatea expresiei genei actinei în diferite condiții experimentale calculate de GeNorm.

A: Stabilitatea genei actinei D. citri din testele de hrănire în dieta artificială; B: Stabilitatea genei actinei D. citri din testele de hrănire în planta prospectă.