Karolina Konstantynowicz-Nowicka

1 Departamentul de Fiziologie, Universitatea de Medicină din Bialystok, 15-089 Bialystok, Polonia

Klaudia Berk

1 Departamentul de Fiziologie, Universitatea de Medicină din Bialystok, 15-089 Bialystok, Polonia

Adrian Chabowski

1 Departamentul de Fiziologie, Universitatea de Medicină din Bialystok, 15-089 Bialystok, Polonia

Irena Kasacka

2 Departamentul de histologie și citofiziologie, Universitatea de Medicină din Bialystok, 15-089 Bialystok, Polonia

Patrycja Bielawiec

1 Departamentul de Fiziologie, Universitatea de Medicină din Bialystok, 15-089 Bialystok, Polonia

Bartłomiej Łukaszuk

1 Departamentul de Fiziologie, Universitatea de Medicină din Bialystok, 15-089 Bialystok, Polonia

Ewa Harasim-Symbor

1 Departamentul de Fiziologie, Universitatea de Medicină din Bialystok, 15-089 Bialystok, Polonia

Abstract

1. Introducere

2. Rezultate

2.1. Modificări ale concentrației de lipide hepatice

Nivelul FFA la omogenizarea ficatului după administrarea unei diete bogate în grăsimi (HFD) crește semnificativ în a doua (a doua săptămână: + 68%; p Figura 1 A), a treia (a 3-a săptămână: + 44%; p Figura 1 A) și a cincea (A 5-a săptămână: + 90%; p Figura 1 A) săptămâna de hrănire în comparație cu grupul standard de control chow. Mai mult, o dietă bogată în grăsimi a crescut considerabil conținutul de DAG (prima săptămână: + 45,5%; p Figura 1 B) și TAG (prima săptămână: + 129,5%; p Figura 1 C) în fiecare săptămână de hrănire a animalelor. Interesant, nivelul de sfingomielină în ficatul grupului HFD a fost crescut numai în prima (prima săptămână: + 30,6%; p Figura 1 D) și a doua (a doua săptămână: + 31,5%; p Figura 1 D) săptămâni de dieta.

hrănirea

Western blots reprezentative care arată expresia proteinelor implicate în transportul acizilor grași în afara celulei, adică transportorul de casete care leagă ATP A1 (Abca1) (A) și proteina de transfer triacilglicerol microsomal (Mtp) (B) în ficatul se omogenizează din grupul martor (0 săptămână) și grupul HFD la sfârșitul fiecărei săptămâni experimentale (1, 2, 3, 4 și 5). Expresia proteinei a fost măsurată folosind metoda Western blot așa cum a fost descrisă în secțiunea „Materiale și metode”. Datele sunt exprimate ca medie ± S.D. și se bazează pe șase determinări independente (n = 6). * p Figura 4 A). Spre surprinderea noastră, expresia acidului gras sintază (Fas) din omogenatele hepatice a scăzut semnificativ în fiecare săptămână, cu excepția primei săptămâni a unei diete bogate în grăsimi. (A doua săptămână: -42,3%; a 3-a săptămână: -49,4%; a 4-a săptămână: -54,9%; a 5-a săptămână: -51%; p Figura 4 B). Cu toate acestea, hrana bogată în grăsimi a provocat o creștere a expresiei elongazei 3 (Elovl3) și a elongazei 6 (Elovl6) în comparație cu grupul standard hrănit cu chow (Elovl3: săptămâna a 2-a: + 19,7%; p Figura 4 C Elovl6: săptămâna a 4-a: + 33,4%; p Figura 4 D). Mai mult, am observat o creștere semnificativă a expresiei beta-hidroxiacil-CoA dehidrogenazei (β-had) la sfârșitul studiului nostru în comparație cu grupul martor (săptămâna a 4-a: + 34,5%; p Figura 4 E). Scăderea expresiei stearoil-CoA desaturazei 1 (Scd1) a fost observată în ficatul șobolanilor HFD, dar nu a atins un nivel semnificativ (Figura 4 F).

2.6. Modificări ale raportului de alungire și desaturare

Raportul 18: 0/16: 0 a fost crescut în timpul alimentării cu diete bogate în grăsimi în fracțiune FFA în fiecare săptămână a studiului nostru (prima săptămână: 0,24; a doua săptămână: 0,38; a 3-a săptămână: 0,47; a 4-a săptămână: 0,43; a 5-a săptămână: 0,46; p Figura 6 A) și în fracțiile DAG și TAG în prima, a doua și a cincea săptămână, comparativ cu grupul standard hrănit cu chow (DAG: prima săptămână: 0,73; a doua săptămână: 0,74; a 5-a săptămână: 0,7; TAG: prima săptămână: 0,15; a doua săptămână: 0,13; a 5-a săptămână: 0,11; p Figura 6 A). În sfingomielină, am observat o creștere semnificativă a raportului 18: 0/16: 0 în a doua și a cincea săptămână în comparație cu grupul martor (săptămâna a 2-a: 0,6; săptămâna a 5-a: 0,48; p Figura 6 A). Raportul 20: 0/18: 0 a crescut doar în fracțiunea sfingomielină, în prima, a treia și a patra săptămână, ceea ce a fost semnificativ statistic comparativ cu chow-ul hrănit standard (prima săptămână: 0,09; a 3-a săptămână: 1; a 5-a săptămână: 0,09; p Figura 6 B). Mai mult, am arătat o creștere semnificativă a raportului FFA 22: 0/20: 0 în a doua, a treia și a cincea săptămână a dietei bogate în grăsimi (a doua săptămână: 7.6; a treia săptămână: 8.6; a cincea săptămână: 7.6; p Figura 6 C). În schimb, raporturile 22: 0/20: 0 ale TAG și sfingomielinei au scăzut în fiecare săptămână a studiului nostru în comparație cu grupul de control (TAG: prima, a 2-a, a 3-a, a 4-a, a 5-a săptămână: 0,01; p Figura 6 C).

2.7. Modificări ale raportului lipogenezei De Novo (raportul n-3 16: 0/18: 2), activitățile căilor n-3 (20: 5 + 22: 6)/18: 3) și ale căilor n-6 (20: 4/18: 2 n-6).

HFD a provocat o reducere semnificativă a raportului FFA 16: 0/18: 2n-3 de la a doua săptămână până la sfârșitul studiului nostru (a doua săptămână: 0,35; a 3-a săptămână: 0,28; a 4-a săptămână: 0,27 a 5-a săptămână: 0,27; p Figura 7 A) comparativ cu grupul de control. În mod similar, raportul lipogenezei DAG și TAG de novo a scăzut semnificativ pe tot parcursul hrănirii HFD, iar scăderea a fost mai pronunțată în a cincea săptămână a studiului nostru (DAG: prima săptămână: 0,92; a doua săptămână: 0,69; a 3-a săptămână: 0,92; a 4-a săptămână: 0,76; a 5-a săptămână: 0,83; TAG: prima săptămână: 0,95; a 2-a săptămână: 0,93; a 3-a săptămână: 0,82; a 4-a săptămână: 0,83 a 5-a săptămână: 0,88; p Figura 7 A). În contrast, raportul 16: 0/18: 2n-3 în fracțiunea de sfingomielină a crescut semnificativ numai în a treia săptămână de HFD (săptămâna a 3-a: 22,4; p Figura 7 A). Raportul FFA (20: 5 + 22: 6)/18: 3 a crescut considerabil în prima săptămână de hrănire cu HFD și apoi a scăzut de la a doua săptămână până la sfârșitul studiului nostru (prima săptămână: 3,6; a doua săptămână: 1,8; a 3-a săptămâna: 1,5; săptămâna a 4-a: 1,6; săptămâna a 5-a: 1,5; p Figura 7 B). În timp ce dieta bogată în grăsimi a provocat reducerea semnificativă a raportului DAG (20: 5 + 22: 6)/18: 3 din a doua săptămână a studiului nostru (DAG: a doua săptămână: 2,5; a 3-a săptămână: 2,3; a 4-a săptămână: 2.1; săptămâna a 5-a: 2.22; p Figura 7 B).

2.8. Modificări histologice hepatice

Imagini histologice reprezentative care prezintă colorarea hepatică a hematoxilinei-eozinei (H + E) din grupul martor (0 săptămână), A) și grupul HFD la sfârșitul primului (B), al doileaC), al treilea (D), Al patruleaE) și al cincilea (F) săptămână experimentală. Datele se bazează pe șase determinări independente (n = 6) ale aceluiași fragment de lob de la fiecare șobolan. Mărire originală de 200 × și lungimea barei de calibrare este de 50 µm.

Imagini histologice reprezentative ale secțiunilor hepatice care prezintă acumularea de picături de lipide colorate de O roșu de ulei din grupul de control (0 săptămână, A) și grupul HFD la sfârșitul primului (B), al doileaC), al treilea (D), Al patruleaE) și al cincilea (F) săptămână experimentală. Datele se bazează pe șase determinări independente (n = 6) ale aceluiași fragment de lob de la fiecare șobolan. Mărire originală de 200 × și lungimea barei de calibrare este de 50 µm.

Scorul de activitate NAFLD al secțiunilor hepatice, adică scorul steatozei hepatice (A), scor de balonare a hepatocitelor (B), scor de inflamație (C) și NAS total (D) din grupul de control (0 săptămână) și grupul HFD la sfârșitul fiecărei săptămâni experimentale (1, 2, 3, 4 și 5). Au fost utilizate imagini histologice pentru sistemul de notare așa cum este descris în secțiunea „Materiale și metode”.

3. Discuție

În concluzie, putem suspecta că o dietă bogată în grăsimi a afectat treptat metabolismul lipidelor hepatice, îndepărtându-se de sinteza acizilor grași benefici, cum ar fi acidul nervonic, către acumularea excesivă de lipide proinflamatorii, în special în fracțiunea TAG. Cu toate acestea, studiul nostru a arătat în mod clar progresia simultană a mecanismelor de protecție împotriva lipotoxicității exprimată ca acumulare excesivă de TAG în ficat, β-oxidare lipidică intensificată și eflux de circulație. Mai mult, redistribuirea observată a acizilor grași printre fracțiunile lipidice și scăderea concentrației de acid nervonic, în special în sfingomielina plasmatică, reflectând dezvoltarea și progresia NAFLD, are un potențial valoros de a deveni un nou marker de prognostic pentru apariția acestei boli.

4. Materiale și metode

4.1. Animale și design de studiu

4.2. Analiza serului și a lipidelor hepatice

Concentrațiile plasmatice și hepatice ale esterilor metilici individuali ai acizilor grași au fost extrase cu o soluție de cloroform-metanol folosind metoda Folch [26] și separate în fracțiuni de acizi grași liberi (FFA), DAG, TAG și sfingomielină prin cromatografie în strat subțire (TLC) ).) [27]. Ulterior, fracțiile individuale de acizi grași au fost metilate în soluție de metanol 14% în trifluorură de bor și cuantificate în funcție de timpii de reținere a standardelor cu utilizarea procedurii de cromatografie gaz-lichid (GLC Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, SUA, seria 5890 II cromatografie gazoasă HP- coloană capilară innowax echipată cu un detector de ionizare a flăcării) așa cum este descris anterior în detalii [27]. Mai mult, pe baza compoziției acizilor grași, am calculat raportul de alungire (18: 0/16: 0; 20: 0/18: 0; 22: 0/20: 0; 24: 0/22: 0), raportul de desaturare 24: 1/24: 0), raportul lipogenezei de novo (16: 0/18: 2n-3), activitățile căii n-3 (20: 5 + 22: 6)/18: 3) și n-6 (20: 4/18: 2 n-6) în fracțiunea lipidică particulară. Cantitatea de conținut de FFA, DAG, TAG și sfingomielină a fost estimată ca suma speciilor individuale de acizi grași din fracțiunile evaluate și au fost exprimate în nanomoli per gram de țesut.

4.3. Imunoblotarea

Expresia proteinelor implicate direct în lipogeneză (Fas; Cell Signaling, Beverly, MA, SUA), calea de oxidare (Cpt1, β-had; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SUA) și procesul de desaturare și alungire (Elovl3, Elovl6, Scd1; Santa Cruz Biotechnology), precum și proteinele exportatoare de acizi grași: Abca1 (Thermo Scientific, Waltham, MA, SUA) și Mtp (Santa Cruz Biotechnology) au fost detectate prin Western Blotting de rutină așa cum a fost descris anterior în detalii de Konstantynowicz-Nowicka et al. [28]. Pe scurt, concentrația de proteine ​​a fost determinată utilizând metoda acidului bicinconic (BCA) cu ser albumină bovină (BSA) ca standard. Semnalele obținute prin imunoblotare au fost cuantificate densitometric folosind un sistem de vizualizare ChemiDoc (Bio Rad, Varșovia, Polonia). Încărcarea egală a proteinelor a fost confirmată folosind colorarea Ponceau S. Expresia tuturor proteinelor a fost standardizată la expresia Gapdh (Santa Cruz Biotechnology) și controlul a fost stabilit la 100%.

4.4. Histopatologie hepatică

Probele de ficat (același fragment de lob de la fiecare șobolan) au fost colectate pentru studii histologice. Au fost fixați în formalină tamponată cu 10% și prelucrați în mod obișnuit pentru încorporarea în parafină. Secțiunile au fost tăiate la 4 μm grosime și colorate cu hematoxilină-eozină (H + E). Picăturile de lipide din țesuturile hepatice au fost determinate prin colorarea cu ulei roșu O. Fragmentele de ficat proaspăt culese au fost plasate în Tissue-Tek® O.C.T. Sak (Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Olanda), apoi congelate la ™ 30 ° C. Secțiunile groase de 7 μm au fost tăiate pe microtomul înghețat și plasate pe lamele adezive. Secțiunile au fost incubate în propilen glicol timp de 2 minute. și, ulterior, în soluție Oil Red O timp de 6 min. Apoi, secțiunile de țesut au fost diferențiate în 85% propilen glicol timp de 1 min., Clătite de două ori în apă și incubate în hematoxilină timp de 1-2 minute. Secțiunile au fost apoi clătite în apă de la robinet prin procedura obișnuită și acoperite cu un mediu de montare apos. Rezultatele colorării au fost transmise spre evaluare la un microscop Olympus BX41 cu o cameră Olympus DP12 (Hamburg, Germania) sub o mărire de 200 × (obiectiv 20 × și ocular 10 ×).

Steatoza hepatică, inflamația și balonarea hepatocelulară au fost evaluate de patru patologi independenți care nu știau de tipul grupului experimental. Au obținut diagnosticul NAFLD folosind NAS (scorul de activitate NAFLD a variat total de la 0 la 8) [29] ca cel mai popular sistem de notare și stadializare, format din trei părți, după cum urmează:

0 pentru 66% din hepatocitele steatotice.

b) Balonarea hepatocitelor

0 pentru niciun hepatocit balon;

1 pentru câteva hepatocite cu balon;

2 pentru multe hepatocite cu balon.

0 pentru niciun focar inflamator

1 pentru 1-2 focare inflamatorii pe câmp × 20;

2 pentru 2-4 focare inflamatorii pe câmp × 20;

3 pentru> 4 focare inflamatorii pe câmp × 20.

Un scor de> 4 cu steatoză și balonare a hepatocitelor a fost considerat NAFLD.