Cercetări originale

  • Articol complet
  • Cifre și date
  • Referințe
  • Suplimentar
  • Citații
  • Valori
  • Reimprimări și permisiuni
  • PDF

Abstract

Abrevieri

oligodeoxinucleotide care conțin motive CpG

cpg-odn

Introducere

Studii recente efectuate la șoareci au arătat că agonistul TLR3 Poly (I: C) poate converti macrofagele asociate tumorii pulmonare (TAM) de la suporterii tumorilor (M2) la cei cu proprietăți tumorale (M1). 9, 10 Conversia este legată de semnalizarea Poly (I: C) prin adaptorul TICAM-1/TRIF pentru a induce expresia genelor legate de M1 în TAM, spre deosebire de alți agoniști TLR, care activează o cale de semnalizare dependentă de MyD88. Mai mult decât atât, agoniștii TLR3 pot declanșa, de asemenea, un răspuns imun înnăscut 11, 12 și s-a dovedit că induce activitate antitumorală atunci când este utilizat singur sau în combinație cu un vaccin anti-cancer. 13-17 Astfel, agoniștii TLR3 livrați cu aerosoli ar putea îmbunătăți răspunsul antitumoral imun înnăscut indus de CpG-ODN chiar și în prezența unui microambient tumoral imunosupresor.

Aici, am evaluat administrarea cu aerosoli a CpG-ODN combinat cu Poly (I: C) pentru eficacitatea sa în blocarea simultană a imunosupresiei induse de TAM și menținerea activării continue a celulelor imune înnăscute în tratamentul metastazelor pulmonare experimentale cu melanom B16 Aerosolizarea CpG-ODN/Poly (I: C) a fost, de asemenea, evaluată în combinație cu dacarbazină, un agent alchilant utilizat ca standard terapeutic la pacienții cu melanom metastatic inoperabil.

Rezultate

Aerosolizarea CombinedPoly (I: C) și CpG-ODN reduce numărul de macrofage asociate tumorilor care secretă arginază și IL-10

Așa cum s-a observat anterior pentru agonistul TLR9 CpG-ODN7, agonistul TLR3 aerosolizat Poly (I: C) a ajuns în spațiul bronhoalveolar și a recrutat celule imune ale șoarecilor C57BL/6 (5-10 șoareci în aceeași cutie de aerosoli), după cum a demonstrat creștere semnificativă a macrofagelor F4/80 + CD11c- și a celulelor dendritice în suspensii obținute după digestia enzimatică a plămânilor șoarecilor tratați cu poli (I: C) comparativ cu șoarecii tratați cu soluție salină FIG. 1 ).

Publicat online:
Publicat online:
Publicat online:
Publicat online:
Publicat online:
Publicat online:

Pe lângă blocarea conversiei TAM la fenotipul M2, tratamentul Poly (I: C) a demonstrat recent că promovează maturarea celulelor supresive derivate din mieloide (MDSC), celule imature adesea crescute în gazde purtătoare de tumori, făcându-le competente pentru celula NK activare. Într-adevăr, incubația celulelor CD11b + Gr1 + MDSC tratate cu poli (I: C) cu celule NK a indus reglarea în sus a expresiei CD69 pe suprafața celulei NK și a crescut producția lor de interferon-γ. 10 Rezultatele noastre au indicat faptul că combinația poli (I: C) cu CpG-ODN aerosolizat a extins semnificativ frecvența celulelor DX5 + în infiltratele tumorilor pulmonare și a crescut activitatea lor citotoxică împotriva celulelor tumorale B16. Astfel, activarea celulelor NK ar putea depinde de un efect direct al CpG-ODN aerosolizat asupra celulelor NK indus de blocarea macrofagelor supresive, dar și de un efect indirect al Poly (I: C) asupra celulelor NK prin inducerea celulei NK -activarea moleculelor pe MDSC prezente în microambientul tumoral.

În concluzie, studiul nostru identifică administrarea repetată de aerosoli a imunostimulanților, cum ar fi agoniștii TLR9 și TLR3, ca o abordare convenabilă și simplă pentru menținerea locală a activării celulelor imune înnăscute, în timp ce inhibă polarizarea macrofagelor care se infiltrează în tumori la fenotipul M2, minimizând posibilele sistemice ale acestora. efecte secundare. Această strategie ar putea îmbunătăți răspunsul la tratamentele standard cu agenți chimioterapeutici prin menținerea unui microambient imunitar capabil să contracareze creșterea tumorii.

Materiale și metode

Linii celulare și reactivi

Celulele B16 de melanom de șoarece au fost menținute în mod obișnuit la 37 ° C într-o atmosferă de 5% CO2 în mediul Eagle modificat al lui Dulbecco suplimentat cu 10% ser fetal de vițel și 2 mM glutamină. Agonistul TLR-9 purificat, fosforotioat ODN1826 (50-TCCATGACGTTCCTGACGTT-30) conținând motive CpG a fost sintetizat de TriLink Biotechnologies. Acidul polinozinic-policitidilic cu greutate moleculară mică (Poly (I: C)), un analog sintetic al ARN-ului cu două fire (dsRNA) și un agonist al TLR-3, a fost achiziționat de la Invivogen (tlrl-picw-250). Dacarbazina a fost furnizată de Medac GmbH (AIC033645021).

Șoareci și protocoale experimentale

Toate experimentele au fost efectuate folosind șoareci femele C57BL/6 în vârstă de 8 până la 12 săptămâni (râul Charles) menținute în camere cu flux laminar la temperatură și umiditate constante, cu hrană și apă date ad libitum. Experimentele au fost aprobate de Comitetul de etică pentru experimentarea animalelor din cadrul Fundației IRCCS IstitutoNazionaledeiTumori din Milano în conformitate cu orientările instituționale. Șoarecii au fost injectați intravenos (iv) cu 5 × 105 celule de melanom B16 și tratați începând cu 4 sau 7 zile mai târziu cu aerosoli la intervale de 72-96 ore sau cu dacarbazină administrată intraperitoneal (ip) la 70 mg/kg, 5 zile/săptămână timp de 3 sau respectiv 2 săptămâni. Șoarecii au fost cântăriți de două ori pe săptămână. Administrarea de aerosoli a fost efectuată utilizând un sistem de expunere a întregului corp al șoarecelui (EMMS) așa cum este descris. 7 Poli (I: C) (15 mg) sau CpG-ODN (1,5 mg) au fost dizolvate în 5 ml soluție salină și plasate în unitatea de nebulizare pentru a trata până la 10 șoareci așezați în cutia cu aerosoli; șoarecii au fost expuși la aerosoli timp de 15 minute, volumul de 5 ml de lichid din nebulizator fiind aproape consumat în 10 minute. La sfârșitul experimentelor, toți șoarecii au fost eutanasiați și s-au numărat metastazele pulmonare macroscopice. Toate in vivo experimentele s-au repetat cel puțin de două ori.

Examinarea histologică, imunofluorescentă și imunohistochimică a plămânilor

Probele de plămâni obținute de la șoareci tratați cu CpG-ODN, Poly (I: C) sau CpG-ODN/Poly (I: C) așa cum s-a descris mai sus sau netratate au fost fixate în formalină tamponată 10% neutră, încorporată în parafină, secționată la 5 mm și colorat cu hematoxilină și eozină pentru evaluarea histologică prin microscopie cu lumină (Scan Scope Aperio, Nikon).

Analiza PCR cantitativă

Probele de plămâni de șoareci care poartă celule de melanom B16 tratate cu dacarbazină timp de 3 săptămâni sau netratate au fost tăiate în bucăți mici și omogenizate cu reactiv QIAzolLysis (QIAGEN, 79306). ARN-ul total a fost izolat conform instrucțiunilor producătorului și transcrierea inversă a fost efectuată folosind SuperScript III First-Strand (Invitrogen, 18080-044). PCR în timp real a fost efectuat cu Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, P/N 4385612) cu un sistem StepOne Real-Time PCR (Applied Biosystems), utilizând următoarele primeri: RAE1 rev: 5′-CCC TCC TCT GGC CTC TCC TT -3 ′; RAE1 pentru: 5′-CCC CAG TAT CAC CCA GCT TAC AT-3 ′; MULT1 rev: 5′-CAT CCA AGA GAG GTG GTG GT-3 ′; MULT1 pentru: 5′-AGC TCA TGT TGC ACT GGA AA-3 ′. Exprimarea genei a fost normalizată la GAPDH.

Citometrie de flux multi-parametru

In vitro Degranulare NK și teste citotoxice

analize statistice

Datele PCR au fost analizate prin metoda ΔΔCt. Diferențele în diferitele grupuri din toate experimentele au fost comparate folosind testul t Student cu două cozi nepereche.